MagExtractor -Plasmid-利用在Chaotrpic（鹽）試劑存在的情況下，核酸能吸附在硅膠表面的特性，進(jìn)行plasmid DNA的抽提·純化。磁性體使用的是封入的磁珠，所以能夠利用永久磁石很容易地分離回收核酸。磁珠依據(jù)吸附條件，分別對蛋白質(zhì)，DNA，RNA等不同物質(zhì)具有不同的吸附能力，所以能夠簡便地純化核酸。本試劑盒除了作為用于全自動核酸抽提裝置MFX-2000的試劑外，也可以作為手動抽提試劑盒來使用。

 

·能夠從大腸菌中抽提·純化出plasmid DNA

·能夠回收3～6μg的plasmid DNA（50～150ng/μl）^*1，可用于轉(zhuǎn)化，限制酶處理，DNA 測序反應(yīng)等。

       ·能在10～15min之內(nèi)抽提出plasmid DNA。

       ·不使用苯酚、氯仿等危險(xiǎn)溶液。

       ·無需乙醇沉淀。

 

MagExtractor -Plasmid-準(zhǔn)備了四種對應(yīng)于MFX-2000，二種對應(yīng)于手動的操作程序。使用對磁珠不進(jìn)行干燥處理的操作程序（手動操作程序Ⅰ以及MFX-2000的”Speedy”和”Lowcost”等操作程序）所得到的回收液，需要注意以下幾點(diǎn)。

·對于限制酶及轉(zhuǎn)化處理，可直接加以使用。

·瓊脂糖電泳時的Loading Dye必須使用本試劑盒附帶的產(chǎn)品。使

用一般的產(chǎn)品組分時，可能樣品會無法沉淀。

·當(dāng)用于DNA測序時的模板時，乙醇會阻礙測序反應(yīng)，可將回收液置于1.5ml試管內(nèi)，保持試管打開狀態(tài)加溫至78℃ 40min。（也可只加溫處理必要的劑量。參考13頁。）

·為了不讓乙醇混入回收液中，請使用手動操作程序Ⅱ（參

考12～13頁），如果是MFX-2000的場合下，請使用”Dryup”

或”Fullauto”等操作程序。

 

本試劑盒中含有能夠進(jìn)行500次plasmid DNA回收的試劑量。

 

 

 

·滅菌水（蒸餾水或者milliQ水經(jīng)過高溫高壓濕熱滅菌）

·乙醇溶液（99.5％以上的特級品，使用手動法的時候用70％

的乙醇溶液）

       ·微量移液器

       ·微量移液器用的tip頭

使用MFX-2000的場合，必須配備以下物品。

       ·抽提專用試管（Code No：MFX-301）

       ·抽提專用6連試管（Code No：MFX-302）

       ·附帶專用過濾器的tip頭（Code No：MFX-402）

 

 

       ·試劑設(shè)置用試管（50ml用，15ml用，2ml用^*1）

使用手動法的場合，必須配備以下物品

       ·1.5ml小型試管用的磁性臺架（商店有售）

       ·漩渦混合器或者小型試管混合器

       ·簡易臺式離心機(jī)（12,000r.p.m.）

 

MagExtractor -Plasmid-通過以下五個工序?qū)�Plasmid DNA進(jìn)行抽提和純化。

使用MagExtractor -Plasmid-和MFX-2000時，上述的②～⑤可成為自動化操作。

 

       培養(yǎng)含Plasmid DNA的大腸桿菌。培養(yǎng)基可使用和通過LB，TB等堿性SDS法等方法來抽提Plasmid DNA的時候同樣的培養(yǎng)基。由于Plasmid的回收量受拷貝數(shù)量以及菌體數(shù)量影響，推薦使用使MagExtractor -Plasmid-能夠使回收量更加穩(wěn)定的MMI培養(yǎng)基。使用MMI培養(yǎng)基的情況下，菌體量和TB的情況等同（JM109 / pUC18，50μg / ml氨芐青霉素9～11O.D.）。

 

 

       使用MagExtractor -Plasmid-能夠處理的菌體量在手動法時是12～13O.D.，使用MFX-2000時是5～9 O.D.。根據(jù)菌體量和抽提方法的不同所引起的回收量的不同可以參考下圖所示。在使用MFX-2000處理10 O.D.以上的劑量時，有可能會無法進(jìn)行充分的攪拌（pipetting），使得純度下降，請務(wù)必注意。使用angle rotor對1.5ml試管進(jìn)行集菌時，菌體量請按照圖2所示為標(biāo)準(zhǔn)。

       ·請將培養(yǎng)液置于1.5ml試管中。

       ·請用12,000rpm離心分離2min。

       ·請仔細(xì)去除上清部分。

                                          菌體量（O.D.）

       圖1：菌體量的不同引起的回收量的變化（JM109 / pUC18，MMI培養(yǎng)液）

                                    過少    適量     過多

圖2：菌體量的標(biāo)準(zhǔn)

 

·溶解液

       請按照4:1（v:v）的比例對試劑盒中的溶解液Ⅰ^*1，Ⅱ進(jìn)行混合。請將此混合液在室溫下保存，三周后請勿繼續(xù)使用^*2。通過手動法抽提的時候需要150μg / 樣品。使用MFX-2000的時候，請參考第九頁的表【各試劑的使用劑量標(biāo)準(zhǔn)】進(jìn)行制備。

       ·70％乙醇溶液

       只有在使用手動法的時候使用。需要1500μg / 樣品。

 

       在使用MFX-2000前，請務(wù)必閱讀MFX-2000的使用說明書。使用抽提程序中的”Dryup”或”Fullauto”程序時，需要有加溫的功能^*3。請使用標(biāo)準(zhǔn)式樣（加溫，簡易保溫功能 / Code No.：MFX-102）或者是特殊式樣（加溫，電子冷卻功能 / Code No：MFX-103）。

       MFX-2000中準(zhǔn)備了4種可供抽提Plasmid DNA用的操作程序。選擇其中一個，將其號碼輸入在液晶畫面中。

       ·一次操作只能選擇其中一個操作程序。

       ·下表的抽提時間不包含分裝時間。實(shí)際的抽提時間根據(jù)樣品不同

會有所變化，以下表的抽提時間 x 樣品數(shù) x 1.25（小時）為標(biāo)準(zhǔn)。

 

^*1 用途A：用于限制酶處理，轉(zhuǎn)化

用途B：DNA 測序，或使用回收液超過50％時的反應(yīng)。

^*2 通過手動法進(jìn)行去除乙醇的操作后便可以進(jìn)行DNA 測序。

 

^*2 Plasmid DNA的回收量和純度有時會降低。

^*3 如果只使用”Dryup”或”Fullauto”操作程序，請使用基本樣式的

MFX-2000（簡易保溫功能 / Code：MFX-101）。

 

·操作程序 “31：Speed”

適用于限制酶處理以及轉(zhuǎn)化用Plasmid DNA的制備。將再次懸濁液置于MFX-2000中，大約在10min / 樣品下抽提出Plasmid。

·操作程序 “32：Dryup”    “33：Fullauto”

適用于DNA 測序用Plasmid DNA的制備。處理較多菌體（7～9O.D.）時適合使用針對再次懸濁液的 “32：Dryup”，處理較少菌

時（5～6O.D.）時適合使用針對集菌后的菌體的“33：Fullauto”。

·操作程序 “34：Lowcost”

使用通過以下的操作設(shè)置處理過的樣品。由于僅使用專用試管1個/樣品（其他操作程序時3～4個），故能夠以較低成本回收Plasmid DNA，

并能夠在6min / 樣品下實(shí)現(xiàn)限制酶處理，以及轉(zhuǎn)化用的Plasmid DNA的制備。

 

·簡易冷卻時，冷卻block應(yīng)事先在冷藏庫或者冷凍庫內(nèi)冷卻。

       ·請使用附帶專用過濾器的tip頭（Code No：MFX-402）

       ·tip已通過γ射線滅菌。戴上手套將需要量專用tip安裝在tip架中。

       ·關(guān)于tip的安裝位置請閱讀MFX-2000的使用說明書。

 

·將需要量專用tip安裝在tip架中。

 

·請將專用試管設(shè)置在抽提架中。擺放位置根據(jù)操作程序的不同

而有所差異，請按照下表放置試管。

 

·請對加溫block（只限于操作程序32，33），回收block設(shè)置所需樣品數(shù)。

·對抽提架的A～F以及加溫block，請勿使用專用試管以外的其他

試管。否則有可能會產(chǎn)生故障。

·對于回收block，請使用Assist公司的No.72.730試管。^*1

 

·本試劑盒內(nèi)不含有滅菌水和乙醇溶液（99.5％以上的特級品），請

自己準(zhǔn)備。

·請準(zhǔn)備50ml容量試管FALCON 2170，15ml容量試管FALCON

2196，2ml容量試管Assist試管No.72.694。^*1

·根據(jù)樣品數(shù)的不同所需的試劑量也會不同。請根據(jù)第九頁的表，在

指定試管內(nèi)注入所需試劑的必要劑量。

·注入試劑時請以試管上的刻度為標(biāo)準(zhǔn)。

·視操作程序，有可能不需要安裝某些試劑。

·將各試管放置在試劑架中。請將磁珠Ⅰ，Ⅱ再次搖勻，放置

在試劑架處。磁珠設(shè)置好后，請立刻啟動裝置（10分鐘以內(nèi)）。

（否則將產(chǎn)生回收量參差不齊及操作故障。）

·抽提后剩下的試劑可以再次使用（可追加減去的量并設(shè)置在MFX－2000上）。如果不再接下去使用，請將蓋子蓋好保存。如果長時間處于蓋子打開狀態(tài)，液體的組成成分有可能會起變化。

·使用的劑量請不要超過第九頁表中記載的規(guī)定劑量。這是造成試管

塞污染以及液體溢出的原因。

                                                                                               【樣品數(shù)在1～12時的試劑使用劑量】

試劑名	試管容量	分裝量（ml）				設(shè)置 位置
		操作程序號
		31	32	33	34
吸附液	50ml	25	25	25	25	1
滅菌水	50ml	25	25	25	25	2
乙醇溶液	50ml	25	25	25	25	6
磁珠Ⅰ	2ml	1.5	1.5	1.5	不要	7
磁珠Ⅱ	2ml	1.5	1.5	1.5	1.5	8
再次懸濁液	15ml	不要	不要	5	不要	9
溶解液	15ml	5	5	5	不要	10
中和液	15ml	5	5	5	不要	11
溶出液	15ml	5	5	5	5	12

 

【樣品數(shù)在13～24時的試劑使用劑量】

試劑名	試管 容量	分裝量（ml）				設(shè)置 位置
		操作程序號
		31	32	33	34
吸附液	50ml	25	25	25	25	1
滅菌水	50ml	25	25	25	25	2
乙醇溶液	50ml	50	50	50	50	6
磁珠Ⅰ	2ml	1.5	1.5	1.5	不要	7
磁珠Ⅱ	2ml	1.5	1.5	1.5	1.5	8
再次懸濁液	15ml	不要	不要	5	不要	9
溶解液	15ml	5	5	5	不要	10
中和液	15ml	5	5	5	不要	11
溶出液	15ml	5	5	5	5	12

 

       根據(jù)操作程序需要對以下樣品進(jìn)行前期處理。

       ①使用程序31,32時

②使用程序33時

       ·把集菌后的菌體原樣放入樣品孔。

③使用程序34時

 

·將樣品放入樣品孔時，請保持試管蓋開啟狀態(tài)（1～24號樣品的樣

品孔上印有號碼）。

·樣品試管使用通常的1.5ml試管時，請先用剪子如下圖所示進(jìn)行剪斷后再使用。剪斷的時候請務(wù)必注意安全。

 

                                                               請?jiān)诖颂幖魯?/div>

原因	對策
試劑量不足	在C, D, E孔中B/F分離后會分別剩下800μl，720μl及720μl 左右的試劑。如果此溶液量過少的話，則原因是使用的試劑量不足。請加液到規(guī)定劑量。如果回收液過少或者沒有，有可能是沒有安裝溶出液或溶出液少的緣故。
樣品量過多	A, B孔的抽提試管中剩有50μl以上的液體時，可能是因?yàn)榫�體量過多，無法用專用tip吸走。請使用9 O.D.以下的菌體。

原因	對策
磁珠Ⅱ的使用量過少	請使用磁珠Ⅱ的規(guī)定劑量。
吸附液的使用量過少	請使用吸附液的規(guī)定劑量。
用70％以下濃度的乙醇溶液清洗磁珠，或者清洗時間過長	請用70％乙醇溶液洗凈。清洗請不要超過1min。
溶出液過少	請使用50μl以上的溶出液。
Plasmid DNA的拷貝數(shù)過少	使用手動法的情況下，請?jiān)黾映樘嵋?guī)模。菌體量，試劑的使用量可以增加至2倍。不過溶出液也會因此而增加，故回收濃度不會上升。

原因	對策
菌體的溶解，殘?jiān)�的凝聚工序不能正常進(jìn)行	請使用規(guī)定的溶解工序時間及溶解液劑量。此工序下的純度如果偏低，吸附·洗凈時的磁珠就會難以分散，回收液的純度也會因此變差。
用70％以上濃度的乙醇溶液來清洗磁珠，或者洗凈時間過短。	請用70％乙醇溶液清洗，直至磁珠完全分散（1min）。