聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg²⁺存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。兩個(gè)引物分別位于靶序列兩端，同兩條模板的3’端互補(bǔ)，由此限定擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)由一系列的變性→退火→延伸反復(fù)循環(huán)構(gòu)成，即在高溫下模板雙鏈DNA變性解鏈，然后在較低溫度下同過量引物退火，再在適中溫度下由DNA聚合酶催化進(jìn)行延伸。理論上，經(jīng)過N次循環(huán)可使特定片段擴(kuò)增到2n-1，考慮到擴(kuò)增效率達(dá)不到100%，所以通常經(jīng)25到30次循環(huán)可擴(kuò)增到10⁶倍，足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)展開。

常見問題分析與解決方法：

1、無擴(kuò)增條帶

1)酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。

2)模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。

3)變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不全。

4)反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。

5)引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。

6)引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

7)DNA凝膠電泳時(shí)加入陽性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

2、PCR產(chǎn)物量過少

1)退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

2)DNA模板量太少。增加DNA模板量。

3)PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

4)引物量不足。增加體系中引物含量。

5)延伸時(shí)間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間。

6)變性時(shí)間過長(zhǎng)。變性時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散

1)酶量過高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來源的酶。

2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

3)MgCl₂濃度過高。可適當(dāng)降低其用量。

4)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng，而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。

5)引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。

6)循環(huán)次數(shù)過多；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。

7)退火溫度過低。

8)電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質(zhì)量差。

9）若為PCR試劑盒則可能：

①　由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效；

②　試劑盒本身質(zhì)量有問題，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。

10）降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

4、擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)

1)引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

2)循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

3)酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

4)退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng)。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

5)樣品處理不當(dāng)。

6)Mg²⁺濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg²⁺使用濃度。

7)若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。

8)復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。

9)反應(yīng)緩沖液未全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化全并混勻。

10)引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

11)引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。

12)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

13)外源DNA污染。確保操作的潔凈。

5、陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶

試劑，槍頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。

6、條帶大小與理論不符

1)污染。使用全新的試劑和槍頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。

2)模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板。

3)基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。