1 色譜分析法 ：

色譜法是一種分離分析方法。它利用樣品中各組分與流動相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異)，先將它們分離，后按一定順序檢測各組分及其含量的方法。

 

2 色譜法的分離原理 ：

當(dāng)混合物隨流動相流經(jīng)色譜柱時，就會與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同，在同一推動力作用下，各組分在固定相中的滯留時間不同，從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異，使混合物中各組分分離的技術(shù)，稱為色譜法。

 

3 流動相 ——色譜分離過程中攜帶組分向前移動的物質(zhì)。

 

4 固定相 ——色譜分離過程中不移動的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。

 

5 色譜法的特點：

(1)分離效率高，復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體。(2)靈敏度高，可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。(3)分析速度快，一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。(4)應(yīng)用范圍廣，氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。(5)高選擇性:對性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力.。不足之處：被分離組分的定性較為困難。

 

6 色譜分析法的分類 ：按兩相狀態(tài)分類，按操作形式分類，按分離原理分類。

 

7 按兩相狀態(tài)分類 ：

氣相色譜(Gas Chromatography, GC)，液相色譜(Liquid Chromatography, LC)，超臨界流體色譜 (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)。氣相色譜：流動相為氣體(稱為載氣)。常用的氣相色譜流動相有N2、H2、He等氣體，按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜;按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜。液相色譜：流動相為液體(也稱為淋洗液)。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。超臨界流體色譜：流動相為超臨界流體。超臨界流體是一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢而發(fā)展起來的一種新型的色譜分離分析技術(shù)，不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點、低揮發(fā)性的試樣組分，而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。

 

8 按操作形式分類 ：

柱色譜(Column Chromatography, CC):固定相裝在柱管內(nèi);包括填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。紙色譜(Paper Chromatography, PC)固定相為濾紙;采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開而進(jìn)行分離。薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC固定相壓成或涂成薄層;操作方法同紙色譜。

 

9 按分離原理分類 ：

吸附色譜(Absorption chromatography);分配色譜(Partition Chromatography);離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography);凝膠色譜(Gel Chromatography)。

 

10 色譜圖 ：

組分在檢測器上產(chǎn)生的信號強(qiáng)度對時間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況，所以又叫色譜流出曲線。流出曲線的突起部分稱為色譜峰。

 

11 色譜保留值 ：

色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù)，它體現(xiàn)了各待測組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分，在柱中的滯留時間越長，或者說將組分帶出色譜柱所需的流動相體積越大。所以保留值可以用保留時間和保留體積兩套參數(shù)來描述。

 

12 色譜圖上的色譜流出曲線可以說明什么問題 ：

根據(jù)色譜峰的數(shù)目，可判斷樣品中所含組分的最少個數(shù);根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析;根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析;根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u價色譜柱的分離效能;根據(jù)兩峰間的距離，可評價固定相及流動相選擇是否合適。

 

13 分配比 ：分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的質(zhì)量比。

 

14 在色譜流出曲線上，兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù)還是擴(kuò)散速度決定?為什么?

答：分配系數(shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定，兩組分在兩相中分配系數(shù)差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動力學(xué)因素，反映在色譜流出曲線上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾?形狀)。

 

15 色譜理論需要解決的問題 ：

色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。

 

16 組分保留時間為何不同?色譜峰為何變寬?

組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制;(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))。色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制;(兩相中的運動阻力，擴(kuò)散作用)。塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。

 

17 半經(jīng)驗理論 ：

將色譜分離過程比擬作蒸餾過程，將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)(類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程)。

 

18 塔板理論的特點 ：

塔板理論引入了塔板數(shù)和塔板高度作為柱效的衡量指標(biāo);不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同，用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì);柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時，無論該色譜柱的塔板數(shù)多大，都無法分離。

 

19 塔板理論的不足 ：

塔板理論的基本假設(shè)不符合色譜柱的實際分離過程。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的流動相流速下柱效不同的實驗結(jié)果，不能說明色譜峰為什么會展寬，同時未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。

 

20 速率方程：

(也稱范第姆特方程式)：H = A + B/u + C·u ， H：塔板高度; u：流動相的平均線速度(cm/s)。

A ─渦流擴(kuò)散項 ：A與流動相性質(zhì)、流動相速率無關(guān)。要減小A值，需要從提高固定相的顆粒細(xì)度和均勻性以及填充均勻性來解決。對于空心毛細(xì)管柱，A=0。固定相顆粒越小dp↓，填充的越均勻，A↓，H↓，柱效n↑。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。

B/u —分子擴(kuò)散項 ：存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H↑(n↓)，分離變差;;分子擴(kuò)散項與流速有關(guān)，流速↓，滯留時間↑，擴(kuò)散↑;擴(kuò)散系數(shù)：Dg ∝(M載氣)-1/2 ; M載氣↑，B值↓。

C ·u —傳質(zhì)阻力項 ：dp↓， df↓, D ↑ ,可降低傳質(zhì)阻力。

 

21 H - u 曲線與最佳流速 ：

由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影響使得存在著一個最佳流速值，即速率方程式中塔板高度對流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對應(yīng)流速u作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。

 

22 速率理論的要點 ：

組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因;通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⑤d氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效;速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響;各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴(kuò)散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降;柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。

 

23 色譜定性方法 ：

1 、與標(biāo)樣對照的方法 ：利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。

2 、利用文獻(xiàn)保留值定性 ：利用相對保留值r21定性。相對保留值r21僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定相上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進(jìn)行定性鑒定。

 

24 色譜定量分析 ：

1 、定量校正因子 ：試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即：m i = fi’ ·Ai ;絕對校正因子：比例系數(shù)f i ，單位面積對應(yīng)的物質(zhì)量：f i ’ =m i / Ai ;相對校正因子f i ：即組分的絕對校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對校正因子之比。

2 、常用的幾種定量方法 ：

( 1 )歸一化法 ：特點及要求：歸一化法簡便、準(zhǔn)確;進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動對測定結(jié)果影響不大;僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。

(2 )外標(biāo)法 ——標(biāo)準(zhǔn)曲線法：特點及要求：外標(biāo)法不使用校正因子，準(zhǔn)確性較高，操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。

( 3 )內(nèi)標(biāo)法 ：內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求：(a)試樣中不含有該物質(zhì);(b)與被測組分性質(zhì)比較接近;(c)不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng);(d)出峰位置應(yīng)位于被測組分附近，且能分離開;(e)加入量適中并與待測組分接近。內(nèi)標(biāo)法特點 ：內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高，操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動對定量結(jié)果的影響不大;每個試樣的分析，都要進(jìn)行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析;若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定，則：wi=Ai/As *常數(shù)。

 

氣相色譜法

1 氣相色譜法(GC ) ：是以氣體為流動相的色譜分析法。

2 氣相色譜要求樣品 氣化 ，不適用于大部分沸點高和熱不穩(wěn)定的化合物，對于腐蝕性能和反應(yīng)性能較強(qiáng)的物質(zhì)更難于分析。

大約有15%-20%的有機(jī)物能用氣相色譜法進(jìn)行分析。

3 氣相色譜儀的組成 ：氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)。

4 氣路系統(tǒng) ：包括氣源、凈化器和載氣流速控制;常用的載氣有：氫氣、氮氣、氦氣。

5 進(jìn)樣系統(tǒng) ：包括進(jìn)樣裝置和氣化室。氣體進(jìn)樣器(六通閥)：試樣首先充滿定量管，切入后，載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱;液體進(jìn)樣器：不同規(guī)格的微量注射器，填充柱色譜常用10μL;毛細(xì)管色譜常用1μL;新型儀器帶有全自動液體進(jìn)樣器，清洗、潤沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過程自動完成，一次可放置數(shù)十個試樣。

6 進(jìn)樣方式 ：分流進(jìn)樣：樣品在汽化室內(nèi)氣化，蒸氣大部分經(jīng)分流管道放空，只有極小一部分被載氣導(dǎo)入色譜柱;不分流進(jìn)樣：樣品直接注入色譜的汽化室，經(jīng)過揮發(fā)后全部引入色譜柱。

7 分離系統(tǒng) ：色譜柱：填充柱(2-6 mm直徑，1-5 m長)，毛細(xì)管柱(0.1-0.5 mm直徑, 幾十米長)。

8 溫控系統(tǒng)的作用 ：溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù);:氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測器三部分在色譜儀操作時均需控制溫度;氣化室：保證液體試樣瞬間氣化;檢測器：保證被分離后的組分通過時不在此冷凝;色譜柱恒溫箱：準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。

 

9 檢測系統(tǒng) ：作用：將色譜分離后的各組分的量轉(zhuǎn)變成可測量的電信號；指標(biāo)：靈敏度、線性范圍、響應(yīng)速度、結(jié)構(gòu)、通用性。通用型——對所有物質(zhì)均有響應(yīng);

專屬型——對特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng)。檢測器類型：濃度型檢測器：熱導(dǎo)檢測器、電子捕獲檢測器;質(zhì)量型檢測器：氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器。

10 熱導(dǎo)檢測器的主要特點：結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定性好;對無機(jī)物和有機(jī)物都有響應(yīng)，不破壞樣品;靈敏度不高。

11 氫火焰離子化檢測器的特點 ：優(yōu)點：(1)典型的質(zhì)量型檢測器;(2)通用型檢測器(測含C有機(jī)物);(3)氫焰檢測器具有結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)迅速、死體積小、線性范圍寬等特點;(4)比熱導(dǎo)檢測器的靈敏度高出近3個數(shù)量級，檢測下限可達(dá)10-12g·g-1。缺點：(1)對載氣要求高(2)檢測時要破壞樣品，無法回收樣品(3)不能檢測永久性氣體、水及四氯化碳等。

12 電子俘獲檢測器的特點 ：對鹵素、硫、磷、氮、氧有很強(qiáng)的響應(yīng);靈敏度高，可用于痕量農(nóng)藥殘留物的分析;線性范圍較窄。

13 火焰光度檢測器(FPD) ：是一種對含硫、磷化合物具有高選擇性的檢測器。含硫、磷化合物在富氫火焰中燃燒被打成有機(jī)碎片，發(fā)出不同波長的特征光譜。

14 固定相 ：固體固定相：固體吸附劑;液體固定相：由載體和固定液組成;聚合物固定相。

15 固體固定相 ：一般為固體吸附劑，常用的有活性炭，硅膠，氧化鋁和分子篩。優(yōu)點：吸附容量大、熱穩(wěn)定性好、價格便宜;缺點：柱效低、吸附活性中心易中毒，使用前要進(jìn)行活化。應(yīng)用：主要用于惰性氣體、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般氣體和低沸點物質(zhì)。

16 作為載體使用的物質(zhì)應(yīng)滿足的條件 ：表面有微孔結(jié)構(gòu)，孔徑均勻，比表面積大;化學(xué)和物理惰性，即與樣品組分不起化學(xué)反應(yīng)，無吸附作用或吸附很弱;熱穩(wěn)定性好;有一定的機(jī)械強(qiáng)度和浸潤性，不易破碎;具有一定的粒度和規(guī)則的形狀，最好是球形。

17 對固定液的要求 ：在使用溫度下是液體，具有較低的揮發(fā)性;具有良好的熱穩(wěn)定性;對要分離的各組分應(yīng)具有合適的分配系數(shù);化學(xué)穩(wěn)定性好，不與樣品組分、載氣、載體發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)。

18 固定液的分類 ：非極性固定液、中等極性固定液、強(qiáng)極性固定液、氫鍵型固定液。

19 非極性固定液 ：主要是一些飽和烷烴和甲基硅油，它們與待測物質(zhì)分子之間的作用力以色散力為主。組分按沸點由低到高順序流出，若樣品中兼有極性和非極性組分，則同沸點的極性組分先出峰。常用的固定液有角鯊?fù)?異三十烷)、阿皮松等。適用于非極性和弱極性化合物的分析。

20 中等極性固定液 ：由較大的烷基和少量的極性基團(tuán)或可以誘導(dǎo)極化的基團(tuán)組成，它們與待測物質(zhì)分子間的作用力以色散力和誘導(dǎo)力為主，組分基本上按沸點順序出峰，同沸點的非極性組分先出峰。常用的固定液有鄰苯二甲酸二壬酯、聚酯等，適用于弱極性和中等極性化合物的分析。

21 強(qiáng)極性固定液：含有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，它們與待測物質(zhì)分子間作用力以靜電力和誘導(dǎo)力為主，組分按極性由小到大的順序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等，適用于極性化合物的分析。

22 氫鍵型固定液：是強(qiáng)極性固定液中特殊的一類，與待測物質(zhì)分子間作用力以氫鍵力為主，組分依形成氫鍵的難易程度出峰，不易形成氫鍵的組分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，適用于分析含F(xiàn)、N、O等的化合物。

23 固定液的選擇：①按極性相似原則選擇：極性相似，溶解度大，分配系數(shù)大，保留時間長:②按官能團(tuán)相似選擇：酯類---酯或聚酯類固定液;醇類---聚乙二醇固定液。③按主要差別選擇：各組分間沸點是主要差別----非極性固定液;極性為主要差別----極性固定液。④選擇混合固定液：對于難分離的復(fù)雜樣品，可選用兩種或兩種以上固定液。

24 聚合物固定相：既可作為固體固定相，也可作為載體，又稱高分子多孔微球。物質(zhì)在其表面既存在吸附作用，又存在溶解作用。(1)具有較大的比表面積，表面孔徑均勻(2)對非極性及極性物質(zhì)無有害的吸附活性，拖尾現(xiàn)象小，極性組分也能出對稱峰(3)由于不存在液膜，無流失現(xiàn)象，熱穩(wěn)定性好(4)機(jī)械強(qiáng)度和耐腐蝕性較好，系均勻球形，在填充柱色譜中均勻性、重現(xiàn)性好，有助于減少渦流擴(kuò)散。

25 載氣種類的選擇：檢測器的適應(yīng)性;載氣流速的大小。

26 柱溫的選擇：

(1)首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度(超過該溫度固定液易流失)和最低使用溫度(低于此溫度固定液以固體形式存在)范圍之內(nèi)。

(2)提高柱溫，可以改善傳質(zhì)阻力，有利于提高柱效，縮短分析時間，但降低了容量因子和選擇性，不利于分離。一般的原則是：在使最難分離的組分盡可能分離的前提下，盡量采用較低的柱溫，但以保留時間適宜，峰形不拖尾為度。

(3)柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點時的溫度。

(4)組分復(fù)雜，沸程寬的試樣，采用程序升溫。

27 載體和固定液含量的選擇：配比：固定液在載體上的涂漬量，一般指的是固定液與擔(dān)體的百分比，填充柱的配比通常在5%～25%之間。配比越低，擔(dān)體上形成的液膜越薄，傳質(zhì)阻力越小，柱效越高，分析速度也越快。配比較低時，固定相的負(fù)載量低，允許的進(jìn)樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。

28 進(jìn)樣條件的選擇：進(jìn)樣量應(yīng)控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內(nèi)。進(jìn)樣要求動作快、時間短;氣化室一般較柱溫高30~70°C。

29 提高色譜分離能力的途徑：(1)塔板理論：增加柱長，減小柱徑，即增加柱子塔板數(shù);(2)速率理論：減小組分在柱中的渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力，可降低塔板高度。

30 毛細(xì)管色譜柱的結(jié)構(gòu)特點：

(1) 不裝填料阻力小，長度可達(dá)百米的毛細(xì)管柱，管徑0.2mm。

(2)氣流單途徑通過柱子，消除了組分在柱中的渦流擴(kuò)散。

(3)固定液直接涂在管壁上，總柱內(nèi)壁面積較大,涂層很薄，則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。

(4)毛細(xì)管色譜柱柱效高達(dá)每米3000～4000塊理論塔板，一支長度100米的毛細(xì)管柱，總的理論塔板數(shù)可達(dá)104～106。

31、毛細(xì)管色譜具有以下優(yōu)點：

(1)分離效率高：比填充柱高10～100倍;

(2)分析速度快：用毛細(xì)管色譜分析比用填充柱色譜速度；

(3)色譜峰窄、峰形對稱。較多采用程序升溫方式;

(4)靈敏度高，一般采用氫焰檢測器；

(5)渦流擴(kuò)散為零。

32、毛細(xì)管色譜的類型：

(1)涂壁毛細(xì)管柱：將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對簡單，但柱制備的重現(xiàn)性差、壽命短。

(2)多孔層毛細(xì)管柱：在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒。構(gòu)成毛細(xì)管氣固色譜。

(3)載體涂漬毛細(xì)管柱：將非常細(xì)的擔(dān)體微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效較涂壁毛細(xì)管柱高。

(4)化學(xué)鍵合或交聯(lián)毛細(xì)管柱：將固定液通過化學(xué)反應(yīng)鍵合在管壁上或交聯(lián)在一起。使柱效和柱壽命進(jìn)一步提高。