1.CT值比較靠后，對(duì)實(shí)驗(yàn)有一定的影響，因?yàn)榻?jīng)過那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時(shí)候擴(kuò)增效率會(huì)有所改變（而定量 PCR 的理論基礎(chǔ)就是每次循環(huán)的擴(kuò)增效率我們認(rèn)為是確定的一個(gè)值）。因此最好能夠把CT 值往前移。

解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。

2. 為什么合成的引物做不加摸板的對(duì)照也能擴(kuò)增出目的條帶，而內(nèi)參用同樣體系就沒有呢?

引物被污染。

3. 實(shí)時(shí)定量 PCR，熒光定量 PCR，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，real－time PCR，這些是不是同一個(gè)概念？

是一個(gè)概念。

4. 我的標(biāo)準(zhǔn)曲線的 slope 總是大于４，而且每個(gè)梯度的平行 ct 值差別比較大，原因？

這個(gè)斜率是＝1/LOG 10(擴(kuò)增效率)，理論上擴(kuò)增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大于 4，說明擴(kuò)增效率比較小�？梢钥疾橐幌路磻�(yīng)體系是否合理？酶活是否正常？

平行管的 CT 值差別大可以考查一下自己實(shí)驗(yàn)操作是否規(guī)范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會(huì)導(dǎo)致 CT 值差別比較大。

當(dāng)斜率為 4 的時(shí)候，擴(kuò)增效率是 77.8%，斜率大于 4 的話，效率繼續(xù)下降。

擴(kuò)增效率的問題實(shí)際就是引物的擴(kuò)增效率，可能酶活的關(guān)系沒有那么重要，前提是試劑盒的質(zhì)量有保證。回到擴(kuò)增效率，只有在引物和模板處于最適比例時(shí)才能得到比較滿意的擴(kuò)增效率，因此通過調(diào)節(jié) PCR 反應(yīng)體系中的引物終濃度來解決，可以做一些引物梯度來比較。

5. ROX 染料是什么作用？

ROX 的作用 ABI 宣稱是用來校準(zhǔn)加樣誤差的。但是據(jù)說 ROX 的作用實(shí)際上是用來校準(zhǔn)光程差的。即每個(gè)孔的熒光信號(hào)經(jīng)過濾光片在經(jīng)過聚焦到CCD的時(shí)候，走過的光程是不一樣的，這樣在 CCD 上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個(gè)差異用 ROX 來計(jì)算孔間差異有多大，然后差異系數(shù)去處理，實(shí)際的熒光信號(hào)。

6. 熒光定量PCR的基線，是怎么確定的呢？

基線就是背景值，因此就是曲線在沒有“起跳”之前的一段。在軟件上有一個(gè)地方可以輸入 baseline 從第幾到第幾 cycle 作為基線。設(shè)置原則是使沒有起跳之前最多的 cycle 的信號(hào)接近0.

7. 熔解曲線出現(xiàn)多峰 (較為理想的熔解曲線是單峰曲線)

非特異性擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：根據(jù)設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)新引物。可通過梯度 PCR 對(duì)引物退火溫度進(jìn)行優(yōu)化;

出現(xiàn)引物二聚體引物設(shè)計(jì)不合理而導(dǎo)致的引物二聚體在熔解曲線內(nèi)峰值一般位于 75℃左右，如該峰顯著請(qǐng)按照以下方面進(jìn)行優(yōu)化：

A.優(yōu)化擴(kuò)增條件，如提高退火溫度，可利用梯度 PCR，摸索最佳的 Tm 值。通常兩步循環(huán)(由 95℃變性步驟直接進(jìn)入 60℃退火和延伸步驟) 有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計(jì)時(shí)設(shè)定的成功退火溫度為 60°C。

B.引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度。通常引物的 Tm 低于目的基因，熔解曲線上峰值在目的基因峰的左邊。大多數(shù)情況下，每條引物的理想最終濃度為 200 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。

C.可通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位于 100 bp 以下。在 PCR 過程中，二聚體的形成與模板的退火及延伸之間存在競(jìng)爭(zhēng)作用。引物二聚體通常隨模板的減少而增加。單獨(dú)采用凝膠電泳分析進(jìn)行驗(yàn)證的缺點(diǎn)在于，其靈敏度最低僅達(dá)到納克級(jí)，因此可能無法得出結(jié)果。凝膠電泳分析的優(yōu)勢(shì)是當(dāng)解離曲線(熔解曲線) 數(shù)據(jù)同時(shí)可用時(shí)，產(chǎn)物的大小有助于對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合解釋;cDNA 模板帶有基因組污染：重新制備 cDNA 模板。

8. 擴(kuò)增曲線形狀異常，如“S”型曲線

• 反應(yīng)體系引起的擴(kuò)增曲線不光滑---擴(kuò)增效率偏差（過高或過低）

A. 擴(kuò)增效率過高

出現(xiàn)非特異擴(kuò)增或引物二聚體：反應(yīng)體系內(nèi)模板濃度太高以及模板核酸質(zhì)量較差（例如，如果采用硅膠柱純化時(shí)，結(jié)合 DNA 或 RNA 的離液鹽可抑制 Taq DNA 聚合酶。如果采用有機(jī)萃取法，則苯酚和乙醇?xì)堄辔镆簿哂邢嗤�的效�?yīng)），可能導(dǎo)致出現(xiàn)抑制 PCR 反應(yīng)的現(xiàn)象。在絕對(duì)定量時(shí)表現(xiàn)擴(kuò)增效率大于 110%。

解決方案：

1）去除模板濃度最高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果效率重新回到 110% 以下，則分析良好；

2）對(duì)目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，一般用克隆的該基因的質(zhì)粒做梯度稀釋，或用 PCR 產(chǎn)物做梯度稀釋，然后做定量擴(kuò)增，通過曲線評(píng)估反應(yīng)效率。絕對(duì)定量有效的擴(kuò)增效率在 90%-110%;

3）重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物。切記應(yīng)延長(zhǎng)干燥時(shí)間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的純化柱加入洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除。

B. 擴(kuò)增效率過低

擴(kuò)增效率過低主要表現(xiàn)在試劑濃度不適（主要是引物、鎂和 Taq DNA 聚合酶，尤其是在多重實(shí)驗(yàn)中），引物對(duì) Tm 之間的差異超過 5°C 以及熱循環(huán)條件不適，試管中各種同源物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)作用可造成反應(yīng)效率低下。絕對(duì)定量表現(xiàn)：擴(kuò)增效率＜90%。解決方案：對(duì)上述因素逐一排除后進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化實(shí)驗(yàn)體系。

C. 個(gè)別擴(kuò)增曲線異常

如個(gè)別擴(kuò)增曲線突然驟降：反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測(cè)到的熒光值突然降低所致。進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)之前要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留

1）儀器設(shè)置不當(dāng)引起的曲線異常

基線設(shè)置不當(dāng)，如擴(kuò)增曲線斷裂或下滑：基線的終點(diǎn)值大于 Ct 值。減小基線終點(diǎn) (Ct值- 4)，重新分析數(shù)據(jù); 基線范圍和閾值設(shè)置不當(dāng)�；�線范圍和閾值都是人為設(shè)定的參數(shù)。二者一般由儀器自動(dòng)默認(rèn)為合適值。在對(duì)同一程序中的多種試劑盒或化學(xué)劑進(jìn)行評(píng)估時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)閾值設(shè)置不當(dāng)造成不同組別數(shù)據(jù)的擴(kuò)增曲線差異：軟件自動(dòng)選擇的閾值更適合平臺(tái)更高的曲線 (下圖中的藍(lán)色曲線)，這將導(dǎo)致此數(shù)據(jù)組中的紅色曲線的 Ct 值出現(xiàn)偏差，因?yàn)槠渥罴验撝当却酥蹈�低。因此，需�?duì)每個(gè)數(shù)據(jù)組進(jìn)行獨(dú)立研究，這樣才能根據(jù)具體情形選擇最佳閾值;

2）Rox 添加不當(dāng)

表現(xiàn)為擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)，需校正參比染料。

9. Ct 值出現(xiàn)太晚

• 擴(kuò)增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計(jì)引物;

• 模板濃度太低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn);

• 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn);

• PCR 產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般將PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為 100 bp-150 bp之內(nèi);反應(yīng)體系中存在PCR 反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時(shí)帶入，模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

10. 陰性對(duì)照也出現(xiàn)明顯擴(kuò)增

• 反應(yīng)體系組分（如，水）被污染：實(shí)驗(yàn)過程中，更換新的 Mix 或者水重復(fù)實(shí)驗(yàn);

• 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺(tái)內(nèi)配制，對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭;

• 引物二聚體的出現(xiàn)：一般在 35 循環(huán)以后陰性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合熔解曲線，PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

11. 絕對(duì)定量時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳

• 加樣誤差：加大模板稀釋倍數(shù)，提高加樣體積;

• 標(biāo)準(zhǔn)品降解：重新制備標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)實(shí)驗(yàn);

• 模板濃度太高：增加模板稀釋倍數(shù)。

12. 反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)

• 擴(kuò)增效率問題：電泳檢測(cè) qPCR 反應(yīng)產(chǎn)物，觀察是否有目的條帶的出現(xiàn)。如果沒有，則需要逐一排查引物、模板以及反應(yīng)條件問題;

• 確認(rèn)引物是否降解：長(zhǎng)時(shí)間未用的引物應(yīng)先通過 PAGE 電泳檢測(cè)完整性，以排除引物降解的可能性;

• 模板濃度太低或目標(biāo)基因表達(dá)豐度過低：減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。另外通�；�因表達(dá)檢測(cè)所需的 cDNA 量為 1 到 100ng。但是如果樣本中目的基因的豐富很低，可能就需要更多的樣本量。檢測(cè)一個(gè)樣本量的范圍，或者更理想的情況下加入陽性對(duì)照反應(yīng)確認(rèn)反應(yīng)本身正常。如果對(duì)期望的表達(dá)水平不是很確定，可重新查詢文獻(xiàn)或 NCBI U

• 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn);

• 逆轉(zhuǎn)錄問題：與低表達(dá)量相關(guān)，如果目的基因在樣本中的豐度很低，需要增加實(shí)驗(yàn)的靈敏度。確認(rèn)一下qPCR 反應(yīng)中沒有加入過量的 cDNA (最大加樣水平為 20% v/v)，因?yàn)檫^量的 cDNA 樣本會(huì)引入抑制劑降低反應(yīng)效率。也可以檢查一下逆轉(zhuǎn)錄酶和引物。隨機(jī)引物通常比基于 oligo(dT) 的方法產(chǎn)生更多的 cDNA。另外，有些逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過熱穩(wěn)定性改造，也會(huì)提高 cDNA 產(chǎn)量。檢查反應(yīng)中的各組分，通過優(yōu)化各組分提高擴(kuò)增效率;確認(rèn)是否是程序設(shè)置不當(dāng)：

• 如是否設(shè)置了信號(hào)采集步驟：兩部法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在 72℃延伸階段;

• 確認(rèn)了上述因素后排查是否反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般設(shè)置循環(huán)數(shù)為 40，但需要注意的是過多的循環(huán)會(huì)增加過多的背景信號(hào)，降低數(shù)據(jù)可信度;

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)問題如果沒有見到任何擴(kuò)增，還可能是引物/探針的設(shè)計(jì)并未針對(duì)正確的靶點(diǎn)。檢查序列數(shù)據(jù)庫如 NCBI 搜尋目的基因的不同變異型。有可能實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)只是針對(duì)了其中一種變異體，但是在所研究的樣本里并無表達(dá)。同時(shí)還要檢查引物/探針靶向的目的基因的區(qū)域，是在編碼區(qū)還是內(nèi)含子？靶向 5’UTR 區(qū)域是不會(huì)檢查到轉(zhuǎn)染到細(xì)胞里的外源基因表達(dá)的 (因?yàn)?5’UTR 區(qū)域是不會(huì)包含在表達(dá)載體質(zhì)粒上的)。類似的情況，如果實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是靶向內(nèi)含子序列的，也是不會(huì)從 cDNA 樣本中得到擴(kuò)增的;

• 產(chǎn)品儲(chǔ)存是否得到：該產(chǎn)品-20℃保存可以長(zhǎng)期保持活性，推薦-20℃保存。4℃保存將會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品活性下降。因反復(fù)凍融也可能導(dǎo)致產(chǎn)品活性下降，因此當(dāng)每次用量較小時(shí)，推薦小體積分裝后-20℃保存。

13. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差

• 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍，擴(kuò)大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中；定量 PCR 儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器;

• 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積;qPCR mix 沒有完全混勻。請(qǐng)使用前充分混勻, 重復(fù)性好的擴(kuò)增曲線：重復(fù)性較理想的擴(kuò)增曲線 STD＜0.2。

14. 絕對(duì)定量中通過以下參數(shù)對(duì) qPCR 結(jié)果加以判定---線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn)

• 相關(guān)系數(shù)（R2）：＞0.98，越接近 1，結(jié)果可信度越高。R＞0.99 或 R2＞0.98；

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3— -3.5，100%擴(kuò)增效率對(duì)應(yīng)的斜率是-3.32；

• PCR 擴(kuò)增效率（E）：90%-110%，越接近 1，越理想。其對(duì)應(yīng)的斜率為 -3.58 至-3.10。效率= 10(-1/斜率)-1；

• 檢測(cè)靈敏度確認(rèn)：35Cycles 內(nèi)可得到好的定量結(jié)果，如果采用 SYBR 檢測(cè)方法，30cycles 內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增；

• NO template control （NTC）確認(rèn)：35cycles 內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生；重復(fù)性:STD＜0.2。

15. 絕對(duì)定量和相對(duì)定量的差別？

• 絕對(duì)定量目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù):相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，而不需要知道它們?cè)诿總�(gè)樣本中的拷貝數(shù);絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線:

• 相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線;相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和 Ct 值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，可以使用絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)操作上更為簡(jiǎn)便易行。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型的做法是將一個(gè)已知 pg 數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。