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激光掃描共聚焦顯微鏡操作步驟及注意事項

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2012-09-14  來源:丁香通
核心提示: 激光掃描共聚焦顯微鏡操作步驟及注意事項

激光掃描共聚焦顯微鏡可測定的樣品種類很多.包括生物材料、組織(切片)、細胞(亞細胞)結構等。樣品中熒光的來源主要有如下幾種:自發(fā)熒光(autofluorescence)、熒光染色、免疫熒光、熒光蛋白、誘發(fā)熒光(induced fluorescence)及酶致熒光(enzymatically produced fluorescence)等等。其中大部分熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長均可在儀器自帶軟件的染料信息庫中找到。
 
1.觀察步驟及儀器操作  根據(jù)實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察;静襟E如下:
 
(1)開啟儀器電源及光源:一般先開啟顯微鏡和激光器,再啟動計算機,然后啟動操作軟件,設置熒光樣品的激發(fā)光波長,選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photo multiplier tube,PMT)檢測器能得到足夠的信號結果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。
 
(2)設置相應的掃描方式:在目視模式下.調整所用物鏡放大倍數(shù),在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式,調整雙孔針和激光強度參數(shù),即可得到清晰的共聚焦圖像。
 
(3)獲取圖像:選擇合適的圖像分辨率,將樣品完整掃描后,保存圖像結果即可。
 
(4)關閉儀器:儀器測定樣品結束后,先關閉激光器部分,計算機仍可繼續(xù)進行圖像和數(shù)據(jù)處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng).則應該在激光器關閉后,待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。
 
2.獲取三維圖像  激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能,因此,它可以在不損傷細胞的情況下,獲得一系列光學切片圖像。選用“Z-Stack"模式,即可實現(xiàn)此項功能。其基本步驟是:
 
①開啟“Z-Stack”選項;
 
②確定光學切片的位置及層數(shù);
 
③啟動“Start”,獲得三維圖像。
 
3.獲取時間序列圖像  共聚焦顯微鏡的"Time-Series"功能,可以自動在實驗者規(guī)定的時間內按照設定的時間間隔獲取圖像。只需設定所需的時間間隔以及所需圖像數(shù)量,開啟“Start T”功能鍵,即可進行實驗。“Time-Series"功能大大減輕了實驗者的勞動強度,對于熒光漂白恢復和鈣離子成像等實驗非常實用。
 
4.注意事項及維護保養(yǎng)
 
(1)儀器周圍要遠離電磁輻射源;
 
(2)環(huán)境無震動,無強烈的空氣擾動;
 
(3)室內具有遮光系統(tǒng),保證熒光樣品不會被外源光漂白;
 
(4)環(huán)境清潔;
 
(5)控制工作溫度在5~25℃。
編輯:songjiajie2010

 
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關鍵詞: 顯微鏡 激光
 

 
 
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