01柱色譜
為向玻璃管中填入固定相，以流動相溶劑浸潤后在上方倒入待分離的溶液，再滴加流動相，因?yàn)榇�分離物質(zhì)對固定相的吸附力不同，吸附力大的固著不動或移動緩慢，吸附力小的被流動相溶劑洗下來隨流動相向下流動，從而實(shí)現(xiàn)分離。

02紙色譜

以濾紙條為固定相，在紙條上點(diǎn)上待分離的混合溶液的樣點(diǎn)，將紙條下端浸入流動相溶劑中懸掛，溶劑因?yàn)槊��?xì)作用沿濾紙條上升，樣點(diǎn)中的溶質(zhì)從而被分離。

03薄層色譜
 

是在玻璃板上涂以固定相涂層，然后點(diǎn)樣，下端浸入溶劑，同樣自下而上分離。常用于探索柱色譜實(shí)驗(yàn)條件，溶劑和固定相的選擇等。

常用固定相有石膏、氧化鋁、蔗糖、淀粉等，常用流動相為水、苯等各種有機(jī)溶劑。

影響色譜柱使用壽命的主要因素

流動相因素

1.流動相pH
 

不同基質(zhì)的填料具有不同的pH適用范圍。常溫下無定形硅膠在純水中的溶解度約為100mg·L-1，且在pH1～9的范圍內(nèi)溶解的硅膠量幾乎是常量，考慮到溶解速度的影響,對于硅膠基質(zhì)的填料,其所能承受的流動相pH范圍約為1～8。

鍵合相硅膠填料則由于鍵合層的屏蔽作用,使填料對流動相的適應(yīng)范圍大大增加，如現(xiàn)在廣泛使用的反相色譜填料C18(十八烷基硅烷鍵合硅膠)，其pH適用范圍可達(dá)2～10。當(dāng)流動相pH值超出酸性范圍時，鍵合相易發(fā)生水解而流失；當(dāng)流動相pH超出堿性范圍時，會加速硅膠的溶解而釋放出絮狀物堵塞柱子，這兩種反應(yīng)均是不可逆反應(yīng)，特別是在溫度較高（>40℃）的環(huán)境下，會使柱效迅速降低而報廢。

2.流動相變質(zhì)

當(dāng)前使用最為廣泛的是硅基鍵合相填料，當(dāng)以水溶液作為流動相或流動相中含有一定濃度的磷酸鹽緩沖液時，水溶液中或緩沖鹽溶液中會滋生出一些細(xì)菌或霉菌，從而堵塞固定相顆粒間的空隙。特別是對于多元自動比例混合的高效液相色譜儀來說,水相或緩沖鹽相獨(dú)立存貯，因存放時間較長而容易發(fā)生此類問題。

3.流動相純度

目前，廣泛使用的填料顆粒粒徑范圍在3～10μm,孔徑在6～10nm,色譜柱在使用中會有大量的流動相通過,如流動相含有微量不溶性雜質(zhì)顆粒,則很容易在柱頭部位被截留,久而久之,造成色譜柱機(jī)械性堵塞,引起柱壓升高而無法正常使用。

4.其它因素

如，流動相的極性對柱子也有一定影響，甲醇、水、冰醋酸等極性較大的物質(zhì)會破壞硅膠填料柱，正丁醇、二氯甲烷等極性小的物質(zhì)會破壞化學(xué)鍵合硅膠柱，堿性溶液會破壞陽離子交換樹脂色譜柱,酸性溶液容易損壞陰離子交換樹脂柱。

樣品因素

1.樣品的溶解性

樣品試樣在配制中，如有少量微粒未能完全溶解，則會隨試樣一起進(jìn)入色譜柱，同樣，會沉積在柱頭處，造成色譜柱的堵塞。

2.樣品的純度
 

樣品中可能含有待分析組分以外的各種組分或雜質(zhì)，這些組分或雜質(zhì)可能會在柱內(nèi)產(chǎn)生不可逆吸附，從而，使固定相的活性點(diǎn)被覆蓋，保留特性發(fā)生變化。

3.樣品的化學(xué)性質(zhì)

待測試樣中的各種組分與填料之間應(yīng)具有化學(xué)穩(wěn)定性，比較典型的是在使用氨基鍵合柱時，應(yīng)避免使用含羰基的化合物和流動相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮發(fā)發(fā)希夫(Schiff)縮合而使固定相破壞。

其它因素

影響色譜柱壽命的因素很多，除流動相和樣品因素外，還有其它一些外在因素，如，柱壓的影響，溫度的影響，色譜柱的正確沖洗，色譜柱的正確安裝等。

色譜柱出現(xiàn)問題的解決辦法

色譜柱在使用中最常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正�，F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），以下列舉了部分常見原因及解決辦法：

1.色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染。

解決方法：如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。

2.色譜柱頭的填料被樣品污染。

解決方法：如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。

3.色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出。

解決方法：如確定定是鹽結(jié)晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。

4.流動相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。

解決方法：如果因pH值使用不當(dāng)，很難恢復(fù)。

色譜柱的八大注意事項(xiàng)

1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此，在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。

2.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿�部是水，反之亦然�?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;" />
3.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。

4.選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

5.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右。

6.保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。

7.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相(與柱內(nèi)相同)填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會損失一定的柱效，這是值得的。通常色譜柱壽命在正確使用時可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH=2～9范圍內(nèi)使用。柱子使用一段時間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙稀?br style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;" />
8.新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。每次工作完后，最好用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如，ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4～5天開機(jī)沖洗15分鐘。

色譜柱不使用時應(yīng)該怎樣保存？

如果色譜柱不使用，又該如何進(jìn)行保存呢？下列方法可供參考：

在柱二端包起來，放到盒子里室溫避光保存。毛細(xì)管柱可以用廢舊的隔墊裁成二塊，分別插在毛細(xì)管二段。填充柱用小塑料袋套住，再用細(xì)金屬絲扎起來。因?yàn)榉治鍪矣性S多化學(xué)試劑，特別在櫥內(nèi)會有些氣味，這樣能較好保管色譜柱。放置時也要有序放置，毛細(xì)管柱還是用盒子裝好以免壓壞，在放置時在柱上和記錄本上都做好記錄。

拆下后，兩頭用橡膠墊密封，橡膠墊原本色譜盒子就帶有，如果沒有，用進(jìn)樣墊制作一下就可以了，然后裝在原來的色譜盒子里面，備注上相應(yīng)的信息。通常要求放在干燥的地方，下次使用時，切記進(jìn)樣端和出口端不能裝反。

高效液相色譜柱的正確使用

1.加裝保護(hù)柱

保護(hù)柱的作用是過濾掉來自流動相和樣品的化學(xué)“拉圾”同時也可以有效除去流動相和樣品中的不溶物。盡管現(xiàn)在的色譜儀在流動相吸入口、進(jìn)樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學(xué)污然,因此,加裝保護(hù)柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復(fù)雜混合物和生物樣品時更是保護(hù)分析柱必不可少的措施。

保護(hù)柱填料應(yīng)與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護(hù)柱屬消耗品,經(jīng)過一定次數(shù)的樣品分析(50～100次)后,出現(xiàn)柱壓顯著升高或峰形變壞或基線漂移時,應(yīng)考慮更換保護(hù)柱。

2.過濾流動相和樣品

流動相通常由水或緩沖溶液與有機(jī)溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過色譜柱的流動相均應(yīng)過濾,但在實(shí)際操作上應(yīng)視具體情況而有所區(qū)別:當(dāng)有機(jī)溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時,在能確保水和有機(jī)溶劑的質(zhì)量且沒有受到污染時,過濾并無更多實(shí)際意義。

當(dāng)流動相中含有緩沖鹽時,則過濾是必要的,如前所述,當(dāng)緩沖溶液放置一段時間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過48h,冬季一般不超過一周)后,在使用前還應(yīng)重新過濾。

所配制的樣品試液在注入流路系統(tǒng)前均要經(jīng)0.45μm（0.22μm則更好)孔徑濾膜過濾。要注意區(qū)分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過載而起不到過濾作用。

3.凈化樣品

當(dāng)樣品中含有對色譜柱有損害的化學(xué)成分,如產(chǎn)生永久性吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機(jī)分子和強(qiáng)吸附性物質(zhì),以及可能對柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團(tuán)離子。在進(jìn)樣前應(yīng)盡可能對樣品進(jìn)行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分。

4.避免過高的柱壓

雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達(dá)6000psi(磅/平方英寸),但過高及過大的壓力變化均會縮短色譜柱的壽命,避免的方法是：

(1)柱壓過高時,盡可能采用較小的流速,以不超過柱最大允許壓力的一半為宜。

(2)當(dāng)流速較大時,應(yīng)采取流速梯度的辦法使流速分步到位。

(3)使用手動進(jìn)樣閥時,進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快。否則

超過20%的壓力沖擊會很快使柱報廢。當(dāng)使用多柱聯(lián)用時,柱切換要避免在高壓下進(jìn)行。

5.注意溫度和酸堿度

一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過60℃，以低于40℃為宜，特別是在流動相pH接近使用限度時，更應(yīng)降低使用溫度。溫度過高會加快鍵合相的水解和硅膠的溶解，從而，使填料性質(zhì)改變，柱床塌陷，降低柱效，改變峰形。目前的鍵合硅膠色譜柱標(biāo)示的pH適用范圍可達(dá)2～10,但在實(shí)際使用時應(yīng)避免極端的pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用,如必須要在極端的pH條件下使用時,可通過以下方法避免柱損害：

（1）在泵和進(jìn)樣閥之間加裝預(yù)柱(飽和柱)來飽和流動相；

（2）降低使用溫度；

（3）檢驗(yàn)完畢后立即用與所使用的流動相互相混溶的“溫和溶劑”徹底清洗；

6.正確及時的沖洗

開始試驗(yàn)前,應(yīng)了解柱中當(dāng)前是何種溶劑。對于新色譜柱,如無特殊說明均為評價報告中所用流動相。柱中當(dāng)前溶劑一定要與分析樣品所用流動相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過渡。異丙醇是唯一能與各種溶劑混溶的試劑,可作為中介流動相使用。

反相鍵合硅膠柱適宜的保存環(huán)境是純甲醇,如分析用流動相為緩沖液2有機(jī)溶劑,可先用較低甲醇含量(<20%)的甲醇2水置換掉原來的純甲醇,再進(jìn)分析用流動相，以防止在柱內(nèi)發(fā)生鹽的沉淀；試驗(yàn)結(jié)束后,要及時用適當(dāng)?shù)娜軇�沖洗系統(tǒng)并最終過渡到純甲醇沖洗,對于含有緩沖鹽的流動相，最好的辦法是先用與分析用流動相組成完全相同但不含緩沖鹽的溶液進(jìn)行沖洗，再逐步過渡到純甲醇沖洗。