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什么是UPLC?和HPLC有什么區(qū)別?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2021-09-23
核心提示:UPLC是一個(gè)新興的領(lǐng)域,今天就跟大家分享一些干貨。UPLC:超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography)色譜理論認(rèn)
 UPLC是一個(gè)新興的領(lǐng)域,今天就跟大家分享一些干貨。

 

UPLC:超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography)


色譜理論認(rèn)為提高色譜柱的效能(efficiency)就能增加儀器的解析度(resolution),而運(yùn)用粒徑低于2μm的小顆粒無疑是增加效能的好方法。但減小固定相的粒度以增加色譜柱效能一直的色譜儀器科學(xué)的瓶頸,因?yàn)樾☆w粒不僅要求系統(tǒng)能承受高于目前極限壓力(比如9000psi),需要更小的系統(tǒng)體積(死體積),并且需要能適應(yīng)可能只有幾秒峰寬的高速檢測器。


UHPLC:超高效液相色譜 (Ultra-High Performance Liquid Chromatography)


特點(diǎn)是工作壓力超過6000 psi或工作溫度超過環(huán)境溫度的應(yīng)用。由于 UHPLC 應(yīng)用中使用的硬件通?梢猿惺 9000 psi或更高的系統(tǒng)壓力,因此色譜工作人員可以使用由更高級(jí)固相(其顆粒遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的5 μm直徑硅膠)填充的色譜柱。采用顆粒更小的固相不僅可以實(shí)現(xiàn)更高的分辨率,同時(shí)還能縮短整體分析時(shí)間。


HPLC:高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography)


又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支,以液體為流動(dòng)相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。

 

UPLC和HPLC的區(qū)別

 

與傳統(tǒng)的高效液相色譜(HPLC)相比,UPLC具有高分離度(ultra resolution)、高速度(ultra speed)、高靈敏度(sensitivity)等優(yōu)勢。在全面提升HPLC的速度、靈敏度和分離度諸品質(zhì)的同時(shí),保留其原有的實(shí)用性及原理。

 

其最顯著的優(yōu)勢是可以縮短分析時(shí)間,提高工作效率。

 

使用UPLC確實(shí)能明顯縮短分析時(shí)間,提高效率(如某有關(guān)物質(zhì)分析方法,使用HPLC運(yùn)行一針是75分鐘,UPLC完全可以在10分鐘內(nèi)搞定),分析效率提高將近7.5倍。

 

當(dāng)然了,分析效率提高這么多,其配套設(shè)備肯定也不是鬧著玩的。UPLC需要小顆粒雜化填料(1.7um)的色譜柱、更高耐壓(達(dá)15000Psi)、低系統(tǒng)體積的輸液單元。

 

學(xué)會(huì)正確維護(hù)UPLC,避免被領(lǐng)導(dǎo)罵。

 

溶液的制備很關(guān)鍵

 

在色譜系統(tǒng)中,溶液是一個(gè)更重要的部分,那么UPLC中溶液的制備應(yīng)該是怎樣的呢?

 

樣品溶液的制備

 

樣品的制備同樣是過濾和離心兩種方法。

 

過濾:根據(jù)樣品溶液的極性,選擇不同材質(zhì)的0.22um濾膜過濾。

 

濾膜的選擇,要進(jìn)行分析方法確證,濾膜的相容性實(shí)驗(yàn)。

 

此處強(qiáng)調(diào)一下,必須是0.22um,千萬不要用錯(cuò)。

 

離心:采用高速離心的方式(大于10000轉(zhuǎn)/分鐘)。

 

離心的方法一般適用于過濾較困難的溶液,為了保護(hù)UPLC的系統(tǒng),離心完畢后建議再次進(jìn)行過濾。

 

流動(dòng)相的制備

 

所用有機(jī)相應(yīng)是進(jìn)口的色譜級(jí)別。使用的水應(yīng)為超純水,MILLI-Q純水機(jī)生產(chǎn)的即可。

 

配制緩沖鹽溶液應(yīng)該有效期的規(guī)定,根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室SOP規(guī)定。

 

所有的流動(dòng)相用前必須使用0.22um的微孔濾膜過濾。

 

有很多同仁在平衡色譜柱時(shí),因?yàn)槭褂玫氖羌状?水或是乙腈/水系統(tǒng),因?yàn)椴簧婕暗骄彌_鹽溶液,經(jīng)常把過濾這一步省略,再次提醒大家:

 

UPLC系統(tǒng)使用的所有流動(dòng)相均必須經(jīng)過0.22um的微孔濾膜過濾。

 

色譜柱的使用

 

若柱效不佳,將會(huì)浪費(fèi)樣品分析時(shí)間,問題排查時(shí)間,更是浪費(fèi)寶貴樣品。所以色譜柱的使用操作的規(guī)范性,直接決定UPLC的分析效率與數(shù)據(jù)可靠性。

 

首先,應(yīng)與色譜柱的供應(yīng)商溝通,充分了解色譜柱的性能,如反相柱、正相柱、氰基柱、親水柱、離子交換柱等。

 

再次,建立色譜柱的管理SOP,在SOP中規(guī)定色譜柱的登記、啟用、使用及報(bào)廢記錄,便于色譜柱整個(gè)生命周期的管理。

 

色譜柱的啟用

 

色譜柱包裝開啟后一定要閱讀說明書,關(guān)注說明書中的注意事項(xiàng),如pH的適用范圍、流動(dòng)相中能否采用水、平衡時(shí)的流速,保留溶劑等。

 

對(duì)于正相色譜柱來說,最重點(diǎn)的是注意初始流速一定要小,一般0.2ml/min。

 

反相柱就比較麻煩一點(diǎn)了,先用小流速0.2ml/min的甲醇沖洗2小時(shí),再用10%甲醇沖洗2小時(shí),最后過渡到檢品的流動(dòng)相,流速由低逐步增加到目標(biāo)流速。

 

柱子開始使用前,必須確認(rèn)系統(tǒng)適用性測試是否滿足要求,主要關(guān)注理論板數(shù)、分離度、拖尾因子等關(guān)鍵分離參數(shù),驗(yàn)收合格后才能使用。

 

色譜柱的清洗和保存

 

正相色譜柱進(jìn)樣后一般無需刻意清洗,但是需要保存時(shí),必須按照說明書要求選擇溶劑,以免長時(shí)間引起固定相干涸。                        

 

反相色譜柱清洗過程:高水相等度洗脫保證緩沖鹽沖洗干凈后,梯度洗脫的方式過渡到純有機(jī)相,等度洗脫10~30柱體積,柱溫可適當(dāng)提高2~5度,方法運(yùn)行完及時(shí)關(guān)閉柱溫。

 

對(duì)于親水作用色譜柱:最后保存盡量避免使用純有機(jī)相,應(yīng)包含少量的水,比如95%的乙腈。       

 

色譜柱的使用

 

使用色譜柱,應(yīng)輕拿輕放,安裝零死體積。

 

切忌由大流速變化引起的壓力變化對(duì)色譜柱造成機(jī)械損傷,應(yīng)使用逐漸提高流速的方法達(dá)到目標(biāo)流速。

 

建立色譜柱的使用記錄,記錄中體現(xiàn)出理論板數(shù)、分離度拖尾因子、柱壓、保留時(shí)間、流動(dòng)相體系、保存溶劑等信息,一旦發(fā)現(xiàn)參數(shù)異常,以便展開調(diào)查,避免偏差發(fā)生。

 

色譜柱使用過程中,應(yīng)關(guān)注其柱壓、柱效,使用完畢后填寫“色譜使用記錄”。

 

色譜柱最好是專用,帶保護(hù)柱。并且使用過緩沖鹽的色譜柱最好不要用于新項(xiàng)目的方法開發(fā)。

 

低紫外區(qū)的檢測,為了避免“鬼峰”的出現(xiàn),可以使用捕集柱,色譜柱使用完畢后一定要按SOP及時(shí)清洗。

 

對(duì)于鬼峰捕集柱的使用,很多科研單位覺得不可行,不知道如何在標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行表達(dá)。其實(shí)在方法建立過程中,如果鬼峰無法避免,可以在“發(fā)展報(bào)告”中說明使用鬼峰捕集柱的理由,并在標(biāo)準(zhǔn)中如實(shí)描述,以便與廠家或是QC進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移。

 

有關(guān)親水性色譜柱,小編也有些提議:

 

以HILIK色譜柱為例,使用更少或是較弱的極性溶劑可以增加極性化合物的保留。

 

樣品溶解的溶液盡可能接近流動(dòng)相條件的初始條件,然而,極性大的分析物經(jīng)常在有機(jī)溶液中存在溶解度較低的現(xiàn)象,可以先用水溶解樣品,再用乙腈/水溶液進(jìn)行稀釋,需要平衡溶解度和峰形之間的關(guān)系,根據(jù)化合物性質(zhì),具體情況具體分析。

 

色譜柱的報(bào)廢要素

 

1.色譜柱堵塞,壓力升高1000psi。

2.色譜柱污染出現(xiàn)鬼峰、噪音增加、檢測限增大時(shí)。

3.填料塌陷或污染引起色譜圖前沿、拖尾、分叉時(shí)。

4.理論板數(shù)、分離度、拖尾因子按各檢品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行,未規(guī)定的按各國藥典通則規(guī)定執(zhí)行,不符合上述規(guī)定時(shí)。

 

UPLC使用常見問題

 

液相基線噪音干擾

如果出現(xiàn)基線噪音較大的情況,首先應(yīng)該排除檢測器的問題。

 

排查流動(dòng)相問題時(shí),需要重點(diǎn)考慮流動(dòng)相的組成及檢測波長是否發(fā)生了改變?

 

一定要確定您所用儀器上最后使用的流動(dòng)相是什么?為了避免這個(gè)問題,在接上個(gè)人用儀器之前,要連接兩通,用超純水將儀器管路全部清洗一遍。

 

此外還需要考慮流動(dòng)相的互溶性的問題。不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶,超出范圍后就不互溶,使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí),還可能析出鹽的晶體,尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。

 

梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高,為了保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫,以辯證溶劑雜質(zhì)峰。

 

分析弱酸性樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液;分析弱堿樣品時(shí),通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿,常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

 

流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱弱堿性樣品和殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用,減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在此使用的有機(jī)胺也成為減尾劑。

 

要確保所使用流動(dòng)相不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮,從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

 

即使經(jīng)過0.22um濾膜過濾,在保質(zhì)期時(shí)間內(nèi),有的流動(dòng)相仍會(huì)存在長菌、沉淀、結(jié)晶等現(xiàn)象。

 

流動(dòng)相不干凈,進(jìn)入液相系統(tǒng)是非常危險(xiǎn)的,尤其是緩沖鹽。

 

在此有一個(gè)小竅門:用激光筆測試,不干凈的緩沖鹽溶液在激光筆照射時(shí),里面會(huì)看到一條紅線。

 

最后,還有濾膜的相容性問題,有的濾膜可以引起基線及噪音的波動(dòng),遇到這種情況,需要進(jìn)行濾膜篩選。

 

液相壓力波動(dòng)

 

最常見原因是泵內(nèi)有氣泡。

 

其他還有:

 

溶劑進(jìn)口過濾芯堵塞(最好更換新的過濾芯,一旦長菌,是不可逆的)、未充分混勻(尤其是有機(jī)相和水相相差比例懸殊時(shí))、溶劑未脫氣、泵的密封墊老化、出口單向閥實(shí)效、主動(dòng)閥失效等。

 

液相壓力過低包含原因

 

首先想到的是連接管路泄露或其他設(shè)備不密封,如泵頭密封墊。

 

還會(huì)存在溶劑進(jìn)口過濾芯堵塞,溶劑無法通過、溶劑或流速改變、主/被動(dòng)閥失靈、四元比例閥失靈、單向出口閥失靈、色譜柱固定相流失等原因。

 

液相壓力過高包含原因

 

這個(gè)原因各位同仁應(yīng)該都很熟悉,如:色譜柱污染、柱子進(jìn)口過濾芯被污染、PURGE閥過濾芯污染、連接管路堵塞、進(jìn)樣器旋轉(zhuǎn)密封閥被堵塞或進(jìn)樣針或針座被堵塞等。

 

系統(tǒng)優(yōu)化時(shí)所需過度溶劑

 

1.反相和正相相互轉(zhuǎn)換:

 

所用溶劑為異丙醇,原因:排除系統(tǒng)中空氣的最好溶劑。

 

2.使用緩沖液后沖洗系統(tǒng):

 

所用溶劑為二次蒸餾水,原因:再溶解緩沖液結(jié)晶的最好溶劑。

 

3.更換溶劑后:

 

所用溶劑為二次蒸餾水,原因:再溶解緩沖液結(jié)晶的最好溶劑。

編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: 液相色譜
 

 
 
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