反轉錄病毒載體是常用的病毒載體之一。反轉錄病毒的DNA基因組的兩端各有一個長末端重復序列(5'—LTR和3'—LTR)，有一個包裝病毒顆粒時必需的非編碼序列ψ+，同時有三個編碼蛋白質的基因gag、pol和env。反轉錄病毒載體可以容納外源DNA的長度在10 kb左右，以很高的轉染率感染宿主細胞，特別是分裂中的細胞。轉入宿主的細胞后，反轉錄病毒載體隨即整合到宿主細胞基因組內，這種整合的位點是隨機的。反轉錄病毒載體在構建時，刪去了poi、env基因和gag基因的3’端，但保留了病毒顆粒所需的ψ+序列。其目的是在于提高載體的安全性，防止反轉錄病毒進入宿主細胞后進行增殖并包裝成病毒顆粒對宿主細胞造成可能的傷害。這樣，在制備反轉錄病毒載體時，就必須有一個輔助細胞系，這種細胞內有缺陷型病毒可以提供包裝用的外殼蛋白，但自身沒有包裝信號。這樣，反轉錄病毒載體就可利用這些外殼蛋白包裝成病毒顆粒在輔助細胞系內大量擴增。反轉錄病載體多半用于基因治療，由于病毒載體在宿主細胞基因組上隨機插入，人們擔心會引起不安全的后果，這種載體還在不斷改進之中。