國(guó)內(nèi)外對(duì)食品防腐劑的合成、篩選、抗菌性能和抗菌機(jī)理進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究。在食品中添加高濃度食鹽、食糖、醋(乙酸)、乙醇或化學(xué)防腐劑是人們保存食品的傳統(tǒng)方法。但這些小分子食品成分可降低水分活度,使菌體蛋白變性,并影響和改變細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu),其機(jī)理主要是使菌體脫水。由于添加量大,所以通常會(huì)掩蓋或破壞食品自然風(fēng)味。為尋找保持食品固有色、香、味的天然防腐劑進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究。主要集中在研究開發(fā)廣譜、高效、低毒、天然的食品防腐劑。
1 天然防腐劑的主要來(lái)源
1.1 植物性天然防腐劑
Knobloch(1998)等對(duì)植物芳香精油的抗菌能進(jìn)行了研究,其抗菌性能則基于抗菌劑在菌體細(xì)胞膜雙磷脂層中的溶解度;而精油中的類萜類降低
生物膜的穩(wěn)定性并干擾能量代謝的酶促反應(yīng)。佐藤昭子(1990)、馬慕英(1993)、席嶼芳等(1993)研究出大蒜、洋蔥、生姜汁液中辛辣組份可抗青、綠霉菌。Kyung和Fl℃rning(1994)發(fā)現(xiàn)不含辛辣成分的白菜汁液在酸性條件下對(duì)乳酸菌有一定抑制作用。Hoffmann等(1992)曾報(bào)道植物糖苷也有抗真菌活性。日本Muroi和Kubo等人發(fā)現(xiàn)蘋果中最有效的抗菌活性物質(zhì)是己稀醛,綠茶中是nero2ledol,腰果中是漆樹酸。
1.2 動(dòng)物性天然防腐劑
近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)細(xì)菌、疫苗、某些化學(xué)物質(zhì)及超聲波誘導(dǎo)處理后,昆蟲體液內(nèi)產(chǎn)生一些殺菌的物質(zhì),其中有一類由數(shù)十個(gè)氨基酸殘基組成,稱為抗菌多肽。姜明等也從柞蠶中誘導(dǎo)出抗菌肽,在pH3~6,濃度2%以上時(shí),殺菌速度大于大腸桿菌增殖速度,其作用機(jī)理是殺菌。在食品領(lǐng)域研究最多的則是昆蟲抗菌多肽(Cecropin)。
1.3 微生物防腐劑
用發(fā)酵法生產(chǎn)溶菌酶作為食品防腐劑是成功先例Nakamura等人采用酶修飾法先后合成了溶菌酶)環(huán)糊精和溶菌酶)半乳甘露聚糖,這些糖蛋白抗菌活性比溶菌酶更高,還具有良好的乳化性能。Ibrahim等合成了脂�；芫�,其抗菌性依脂肪酸烷鏈增長(zhǎng)而提高。Norman(1994)發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌肽(nisin),枯草桿菌素(subtilin)等微生物抗菌肽中含有的稀有氨基酸及環(huán)肽結(jié)構(gòu)是抗菌活性的原因所在。
2 天然肽類防腐劑的研究
在天然防腐劑中,有一大類屬肽類防腐劑,由于其安全無(wú)毒害,且對(duì)人體有一定營(yíng)養(yǎng)保健作用而受到人們廣泛關(guān)注,成為防腐劑的研究熱點(diǎn)。
2.1 溶菌酶
溶菌酶Lysozyme是一種專門作用于細(xì)胞壁的水解酶,存在于人的唾液、眼淚、蛋清、哺乳動(dòng)物乳汁、植物和微生物中。它對(duì)人體安全無(wú)毒,無(wú)副作用,且具多種營(yíng)養(yǎng)與藥理作用,所以是一種安全天然防腐劑。溶菌酶是一種比較穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì),在酸性下最穩(wěn)定。在pH3時(shí)能耐100℃加熱40min,在中性和堿性條件下耐熱性較差,pH7時(shí)100℃處理10min就失活。研究最多的雞蛋清溶菌酶由129個(gè)氨基酸殘基組成,具有4個(gè)二硫鍵,分子相對(duì)質(zhì)量為14000,最適pH為6~7,最適溫度為50℃。
前發(fā)現(xiàn)的微生物溶菌酶大體有以下5種。
(1)內(nèi)N)乙酰己糖胺酶,此酶可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的B)1,4糖苷鍵。
(2)酰胺酶,能切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中NAM與肽/尾0之間的N)乙酰胞
壁酶)L)丙氨酸鍵。
(3)內(nèi)肽酶,使肽/尾0及肽/橋0內(nèi)的肽鍵斷裂。
(4)B)1,3、B)1,6葡聚糖和甘露聚糖酶,此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁。
(5)殼多糖酶,分解霉菌細(xì)胞壁。因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁幾乎全部由聚多糖組成,因此主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌起作用。
2.2 昆蟲抗菌肽
抗菌肽的一個(gè)典型特征是在一個(gè)長(zhǎng)的疏水片段后面連有一個(gè)強(qiáng)堿性的N)端區(qū)域。昆蟲抗菌肽(Cecropin)由37個(gè)氨基酸殘基組成,N端呈堿性,
帶正電荷,親水;C端酰胺化,中性或微酸性,不帶電荷或少量負(fù)電荷,疏水。5~12位和25~37位構(gòu)成2個(gè)螺旋區(qū)域。抗菌肽的抗菌機(jī)理是在微生物細(xì)胞膜上形成通道,引起細(xì)胞質(zhì)溢流。關(guān)于通道形成的具體過程有
不同的幾種假說,Chistensen等認(rèn)為通道的形成可分為3個(gè)步聚:
(1)抗菌肽分子通過靜電作用被吸附到膜表面;
(2)抗菌肽分子中的疏水尾巴插入細(xì)胞膜;
(3)抗菌肽分子的兩性分子A螺旋插入膜中,多個(gè)抗菌肽分子共同作用形成離子通道。而Fik等認(rèn)為抗菌肽作用于細(xì)胞膜時(shí),N端的兩親螺旋結(jié)合在膜表面,只有C端的疏水螺旋插入膜中,進(jìn)而形成離子通道。Clagu℃等認(rèn)為抗菌肽通過作用于膜蛋白,引起蛋白質(zhì)由凝聚失活,細(xì)胞膜變性而形成離子通道。
2.3 魚精蛋白
魚精蛋白是一種在魚類精核中發(fā)現(xiàn)的聚陽(yáng)離子肽,有廣譜抑菌活性,能抑制枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌等的生長(zhǎng),分子富含蛋白質(zhì)和精氨酸。
從分子組成上看,魚精蛋白不具有兩親性,因?yàn)榉肿又械?2個(gè)氨基酸中21個(gè)為精氨酸,由于其多為陽(yáng)離子、非兩親性質(zhì),而無(wú)法插入細(xì)胞膜內(nèi)而形成膜通道。魚精蛋白的作用機(jī)制是抑制線粒體電子傳遞系統(tǒng)中的一些特定成分,抑制一些細(xì)胞膜有關(guān)的新陳代謝過程。
魚精蛋白適用于較大pH范圍內(nèi)使用,在中性和偏堿性條件下防腐效果更好。目前應(yīng)用最廣的防腐劑多為酸型防腐劑,只在酸性條件下有效,而在中性乃至偏堿性的食品中使用,效果明顯下降。魚精蛋白的開發(fā)使用就可拓寬防腐劑使用的pH范圍,而且不需調(diào)整對(duì)象食品的pH。魚精蛋白的熱穩(wěn)定性,使它可以與食品熱處理并用。而它的抗菌活性可受食品中無(wú)機(jī)鹽的影響,而略有下降,尤其是二價(jià)金屬離子影響較大,主要營(yíng)養(yǎng)成分蛋白質(zhì)、脂肪、糖類對(duì)魚精蛋白的抗菌活性影響較小,這使它在富含糖類和蛋白質(zhì)類的食品中應(yīng)用成為可能。但根據(jù)國(guó)外報(bào)道,從魚精蛋白的進(jìn)化特點(diǎn)考慮,在含核酸較多的食品或含酸性多糖類較豐富的食品中其抗菌效果相對(duì)較低。
2.4 乳酸鏈球菌素
乳酸鏈球菌素(Nisin)是乳酸鏈球菌在變性乳介質(zhì)中發(fā)酵生成的一種小分子多肽抗菌物質(zhì),由34個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為3510道爾頓,活
性分子常是二聚體或是四聚體。Nisin中含有5個(gè)不同于其它蛋白質(zhì)的二硫鍵(硫氨酸和甲硫氨酸),另外還含有脫氫丙氨酸(DHA),甲基脫氫丙氨酸(DHB)等不飽和氨基酸。
Nisin的溶解度和穩(wěn)定性與溶液的pH值有關(guān),pH值越低,穩(wěn)定性越高,溶解度也提高。如:pH2.5時(shí)溶解度為12%;pH5.0時(shí)下降到4%;在中性和堿性條件下幾乎不溶解,應(yīng)用時(shí)要先用0102N酸溶解,加入食品中。pH2.0時(shí)或更低的稀鹽酸中可以經(jīng)115.6℃滅菌而不失活,但在pH5.0滅菌時(shí)失活40%,pH61.時(shí)將喪失90%的活力。這種熱穩(wěn)定性與其分子中的5個(gè)橋密切相關(guān)。Nisin加入食品后,穩(wěn)定性大大提高,食品中的大分子小分子物質(zhì)對(duì)Nisin有防護(hù)作用。因此,用Nisin來(lái)防腐的食品必須具有穩(wěn)定的酸性。而Nisin與熱處理殺菌作用是互相促進(jìn)的,加入少量的Ni2sin(0124~10ppm)可以大大提高腐敗微生物的熱敏感性。同樣,熱處理也提高了細(xì)菌對(duì)Nisin的熱敏感性,可以降低熱處理強(qiáng)度,保證良好品質(zhì)。另外,輻射處理和Nisin相結(jié)合;山梨酸與Nisin配合使用等可以彌補(bǔ)抗菌譜的缺點(diǎn),而發(fā)揮廣泛的防腐作用。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Nisin的6種類型,分別為A,B,C,D,℃和Z。其中NisinA,NisinZ兩種類型的研究最活躍。二者性質(zhì)基本相同,僅在結(jié)上
有一個(gè)氨基酸差異,Nisin第27位氨基酸殘基是組氨酸(His),NisinZ則是天冬酰胺(Asn)。從分子水平上探尋Nisin的抑菌機(jī)理一直是研
究的熱點(diǎn)。Nisin作用的位點(diǎn)主要是細(xì)胞膜。Palm2eri等對(duì)Nisin存在下雙層脂膜電流和電勢(shì)測(cè)量后,證實(shí)了Nisin形成膜通道的能力。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)小分子和離子通過管道流失,更嚴(yán)重則導(dǎo)致細(xì)胞溶解而達(dá)到殺菌防腐目的。
Nisin不能抑制革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌,專抑制革蘭氏陽(yáng)性菌,特別是細(xì)菌芽孢。Nisin對(duì)孢子的作用有兩點(diǎn)值得注意:
(1)大多數(shù)情況下,對(duì)細(xì)菌孢子的作用方式是抑制孢子萌發(fā)而不是殺死
孢子。它對(duì)于熱加工食品防腐的重要意義在于必須在整個(gè)貨架期中保持足夠的乳酸鏈球菌肽殘留量,以提供對(duì)任何存在孢子的連續(xù)作用;(2)另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是孢子越受到熱損傷,就變得對(duì)乳酸鏈球菌肽越敏感。如經(jīng)121℃熱處理3min后存活下來(lái)的孢子比未經(jīng)加熱損傷的孢子對(duì)Nisin敏感10倍以上。這也是Nisin特別適用于熱加工食品防腐保鮮
的重要原因。
GB2760-86規(guī)定,罐裝食品,植物蛋白食品最大使用量為0.2gPkg;乳制品、肉制品最大使用量為0.5gPkg;一般參考量為0.1~0.2gPkg。
3 天然肽類防腐劑研究趨勢(shì)
3.1 應(yīng)用基因工程方法生產(chǎn)
天然肽類防腐劑多為動(dòng)物體正常蛋白質(zhì),故安全性很高,而且像溶菌酶,魚精蛋白等對(duì)人體還有一定保健作用,所以是一類值得大力開發(fā)的食品防腐劑。但蛋清、魚類精巢等原料的供應(yīng)量很有限,因而妨礙了這些防腐劑的廣泛使用。目前人們正嘗試通過基因工程在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因,但這可能造成縮主微生物自殺而不能獲得表達(dá)產(chǎn)物,以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)抗菌肽基因,雖然可克服這一缺點(diǎn),但仍有表達(dá)產(chǎn)物少的問題。
3.2 肽的分子改造
天然防腐劑與目前廣泛使用的化學(xué)防腐劑相比,抗菌譜窄,抗菌效果差。所以,人們?cè)噲D通過分子修飾來(lái)提高抗菌性能。例如對(duì)昆蟲抗菌構(gòu)效關(guān)系的研究表明,螺旋與抗菌肽的活性密切相關(guān),改變兩性分子螺旋的螺旋度會(huì)影響抗菌肽的活性。如用螺旋度傾向高的氨基酸殘基代替螺旋傾向低的殘基,抗菌肽的活性將明顯提高,相反,降低抗菌肽兩性分子A螺旋度將導(dǎo)致抗菌活性的急劇下降,可見兩性分子螺旋在維持抗菌肽活性中起著重要作用。溶菌酶被咖啡酸共價(jià)修飾后,修飾產(chǎn)物可強(qiáng)烈抑制大腸桿菌等格蘭氏陰性菌的生長(zhǎng),大大加寬了溶菌酶的抗菌譜。溶菌酶被環(huán)糊精和半乳甘露聚糖修飾后,不僅抗菌活性穩(wěn)定,而且具有良好的乳化性能,加工性能大為增強(qiáng)。所以,抗菌肽類分子的改造和設(shè)計(jì)已成為獲得新抗菌肽的主要途徑。
3.3 與其他防腐劑聯(lián)合使用
天然肽類防腐劑常和其他添加劑配合使用增強(qiáng)其抗菌效果。例如螯合劑eDTA,eDTA可從革蘭氏陰性菌中部分除去含脂多糖的外層膜,因而降低了其對(duì)其他防腐劑的抗性。例如,溶菌酶、Nisin等一般只能作用于革蘭氏陽(yáng)性菌,但與eDTA配合使用時(shí)他們對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制能力也大為增強(qiáng)。
4 結(jié)束語(yǔ)
隨著生活水平的不斷提高和對(duì)健康的日益關(guān)注,人們對(duì)防腐劑之類的食品添加劑在安全性能上提出了更高的要求,因此,人們開始把目光投向于天然防腐劑。它已成為食品領(lǐng)域一個(gè)重要研究課題,由于肽類防腐劑所具有的安全無(wú)毒害,甚至對(duì)人體有一定營(yíng)養(yǎng)保健作用等優(yōu)點(diǎn),其研究開發(fā)無(wú)疑是一個(gè)很有前途的重要課題,肽類防腐劑具有廣闊的發(fā)展前景。