實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)自1996年誕生以來，由于它顯著的優(yōu)越性，不僅廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，而且也開始作為一種診斷手段應(yīng)用于臨床。其應(yīng)用涉及到的范圍包括DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析，基因突變分析等多個(gè)領(lǐng)域[3]。
Giulietti 等人[6]對(duì)用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定細(xì)胞因子基因的表達(dá)作了詳細(xì)的描述。細(xì)胞因子是一種調(diào)節(jié)蛋白，它對(duì)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的關(guān)系。由于所得到組織樣本常常因?yàn)樘《荒軡M足在蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)，另外，通常用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法（如ELISA）的靈敏度也難以完成對(duì)極微量的蛋白產(chǎn)物的檢測(cè)，所以應(yīng)用PCR定量進(jìn)行基因診斷就顯得十分有意義。
眾所周知，cDNA微排列和差異表達(dá)PCR技術(shù)是對(duì)基因表達(dá)變化分析的兩種關(guān)鍵技術(shù)，但是這兩種技術(shù)只能對(duì)基因表達(dá)變化進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析。Rajeevan等人[7]利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)卻成功地將基因表達(dá)的變化進(jìn)行了量化，不僅有效地證明了上述兩種方法的有效性，而且提供了一種具有高通量的對(duì)基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)的新技術(shù)。
實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)不僅增強(qiáng)了有關(guān)對(duì)基因量變化的研究方法，而且也增強(qiáng)了對(duì)基因質(zhì)所發(fā)生變化方面的研究。例如Laird和他的同事們[8]建立了一種被稱作Methylight的實(shí)時(shí)定量PCR方法，它能通過特異的引物和/或Taqman探針檢測(cè)基因CpG島的胞嘧啶是否發(fā)生了甲基化。由于實(shí)時(shí)PCR的敏感性和特異性，使得這種方法對(duì)胞嘧啶的過度甲基化常常具有極高的靈敏度。最近有研究表明這種方法可以從食管癌病人的食管粘膜中檢出含有發(fā)生了過度甲基化基因的細(xì)胞[9]。又如Sevall等人[10]證明可以用實(shí)時(shí)定量PCR方法區(qū)分含有突變的等位基因。這是利用兩種不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記Taqman探針，該探針既可同野生型基因又可同突變型基因發(fā)生雜交，由于探針的雜交效率及隨后的切割是由雜交決定的，所以如果出現(xiàn)一種信號(hào)強(qiáng)于另一種信號(hào)則表明兩條基因具有同源性，若兩種信號(hào)都增強(qiáng)則表明為異源性。
目前實(shí)時(shí)定量PCR在臨床診斷方面的應(yīng)用主要體現(xiàn)在對(duì)感染組織或細(xì)胞負(fù)載病毒的定量測(cè)定上，這一技術(shù)對(duì)DNA和RNA病毒都可以檢測(cè)，目前已有標(biāo)準(zhǔn)的操作手冊(cè)供人們使用，但是必須明確，國際上既沒有統(tǒng)一的病毒荷載的標(biāo)準(zhǔn)，也存在著對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量準(zhǔn)確性的各種爭(zhēng)論。這里值得一提的是一種稱為NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技術(shù)[11]，它是一種利用電化學(xué)以光的等溫PCR反應(yīng)，在反應(yīng)過程中能產(chǎn)生一種與靶RNA反極性的RNA擴(kuò)增子，分子beacon常用于這種技術(shù) ，這種方法常常用于對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的定量測(cè)定。
