1. 取RNA
2. 將電泳槽和板,梳齒浸泡在3%H2O2中20-30分鐘,并吹干
3. 跑1%瓊脂糖凝膠,檢測樣本RNA含量
4. 變性膠
在桌面上利用保險膜鋪出一塊干凈的區(qū)域,將1.95g 瓊脂糖加入110ml 的 DEPC-H2O (加熱前可在三角瓶上做一個記號,在加熱后把蒸發(fā)的水分補足)加熱沸騰,冷卻(補水)至60度左右。加入15ml 10xMOPS (PH8.0)和25ml 甲醛,混勻后倒膠,冷卻待用。
5. 電泳液(1L)
100ml 10xMOPS (PH7.0)
800ml DEPC-H2O
100ml 甲醛
6. sample buffer(-70度保存)
1650 μl 體系:
200μl 10xMOPS (PH8.0)
350μl 甲醛
1ml 甲酰胺
100μl loading buffer(DNA用染料)
用槍吹吸混勻
以樣品RNA : sample buffer= 1:3 (v:v) 的比例加入 (RNA marker 同樣)
點樣前 68℃ 5分鐘(RNA marker 同樣)
7.跑電泳
120-150V,大約4-6小時(跑到整塊膠還剩下1/3)每半個小時吸一次陽極的電泳液到陰極(平衡酸堿性),將膠切下。如加RNA marker 則用EB染5’,洗20’,將膠切去一個角作為位置記號。
8. 轉(zhuǎn)膜
轉(zhuǎn)膜液: 20xSSC:
1000ml體系:
175.3g NaCl
88.2g 檸檬酸納
NaOH 調(diào)節(jié)到PH7.0
定容
搭建鹽橋:將20XSSC倒入白磁盤中,上擔一塊玻璃板,用一張大濾紙,兩邊浸入白盤中SSC,注意:防止短路,接觸面不能有氣泡,上反放膠,覆與膠等大的尼龍膜,再覆等大的濾紙,再壓上一疊吸水紙,壓上重物。
9. 壓膜16h以上,期間要換吸水紙。紫外交聯(lián)2’。7XSSC洗15’。用濾紙包膜,以培養(yǎng)皿壓住。
10. 烘膜
80℃ 2h
舊膜以煮沸的洗膜液洗脫兩次,10’每次輕柔震蕩。
11.預雜交
先用水沖洗雜交管,再用洗膜液沖洗。
加5ML 預雜交液(雜交液沒過膜即可)于雜交管中,將膜小心放入用雜交液將膜浸潤,使其貼在管壁上,不可有氣泡,有DNA的一面朝向管內(nèi),放入雜交爐中55度轉(zhuǎn)3hr以上,(舊膜半小時)
12. 探針標記
1. 做柱子
用燒紅的針頭將0.5ml的離心管底部戳一個小洞,加入玻璃纖維將開口堵住,入Sephadex G50 3000rpm 5’,待液體流盡后,加入TE洗滌三次(3000rpm 5’)。
2. 標探針
在離心管中加入探針約2ul(20-70ng, 太多會競爭性吸收同位素),
oligo(kit1) 2μl
buffer(kit2) 2.5μl,
雙蒸水12.5μl,
100℃ 5’,0℃ 5’
再加入dNTP(kit4) 2.5μl.
Klenow 1μl
雙蒸水6ul
-p32-dCTP 1.5μl,
37℃水浴 20-30’
加入TE 100μl,過柱純化,套上大1.5ML 安培管,3000 rpm 3-5min , 再加入100μl TE 洗柱子3000 rpm 3min, 加入4μl 6N NaOH 室溫變性5min(可先將NaOH加入管中)
5.雜交
將探針加入雜交管中(注意不要加在膜上)65℃雜交過夜(大于16小時),膜不能干掉。
6.洗膜
室溫下用少量洗膜液洗滌雜交膜3-5min,注意回收放射性洗液,倒入洗膜液,65℃ 10min 回收洗液,用放射性計數(shù)器測一下放射強度,視放射強度,然后重復1-2次。
7.壓磷屏
用保鮮膜將膜包好(液體要吸干),壓磷屏20hr左右,掃描觀察。