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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于:分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
一、反轉(zhuǎn)錄酶的選擇
1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強的聚合酶活性,RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。
2. 禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。
3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶:在Mn2 存在下,允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA,以消除RNA模板的二級結(jié)構(gòu)。
4.MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體:商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA,這一特性允許從含二級結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。
二、合成cDNA引物的選擇
1. 隨機六聚體引物:當(dāng)特定mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板,PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
2. Oligo(dT):是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細胞mRNA具有3’端Poly(A )尾,此引物與其配對,僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A )RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。
3. 特異性引物:最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應(yīng)用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA,導(dǎo)致更為特異的PCR擴增。
二、 試劑準(zhǔn)備
1.RMA提取試劑
2.第一鏈cDNA合成試劑盒
3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4.Taq DNA聚合酶
三、操作步驟
1. 總RNA的提取:見相關(guān)內(nèi)容。
2. cDNA第一鏈的合成:目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。現(xiàn)以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
(1)在0.5ml微量離心管中,加入總RNA 1-5μg,補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,輕輕混勻、離心。
(2)70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。
然后加入下列試劑的混合物:
10×PCR buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTPmix 1μl
0.1M DTT 2μl
輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5min。
(3)加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。
(4)于70℃加熱15min以終止反應(yīng)。
(5)將管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?br />3.PCR:
(1)取0.5ml PCR管,依次加入下列試劑:
第一鏈cDNA 2μl
上游引物(10pM) 2μl
下游引物(10pM) 2μl
dNTP(2mM) 4μl
10×PCR buffer 5μl
Taq 酶(2u/μl) 1μl
(2) 加入適量的ddH2O,使總體積達50μl。輕輕混勻,離心。
(3) 設(shè)定PCR程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確,可在PCR擴增目的基因時,加入一對內(nèi)參(如G3PD)的特異性引物,同時擴增內(nèi)參DNA,作為對照。
(4) 電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結(jié)果。
(5) 密度掃描、結(jié)果分析:采用凝膠圖像分析系統(tǒng),對電泳條帶進行密度掃描。
四、注意事項
1. 在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂。
2. 為了防止非特異性擴增,必須設(shè)陰性對照。
3. 內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4. PCR不能進入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨實驗來確定。
5. 防止DNA的污染:
(1) 采用DNA酶處理RNA樣品。
(2) 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性

 

 

 
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