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膜蛋白的分離

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

一、簡介:
1
細(xì)胞質(zhì)膜資料
1895
,Overton從研究細(xì)胞透性得出"細(xì)胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成"
1925
Gorter&Grendel:用脂單分子膜技術(shù)測定細(xì)胞膜中脂分子的總面積,提出:"細(xì)胞膜是由雙層脂分子組成"。
1935
Danielli&Davson:從測定膜的表面張力得出細(xì)胞膜的"三明治結(jié)構(gòu)模型",即蛋白質(zhì)-脂-蛋白質(zhì)。
1959
Robertson:用電鏡觀察生物膜提出"單位膜模型",將膜的分子結(jié)構(gòu)與超微機構(gòu)統(tǒng)一起來
厚度: 2() 3.5() 2(暗)=7.5
細(xì)胞質(zhì)膜的主要功能概括如下:
(1)
為細(xì)胞的生命活動提供相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境;
(2)
選擇性的物質(zhì)運輸,包括代謝底物的輸入與代謝產(chǎn)物的排除,其中伴隨著能量的傳遞;
(3)
提供細(xì)胞識別位點,并完成細(xì)胞內(nèi)外信息跨膜傳遞;
(4)
為多種酶提供結(jié)合位點,使酶促反應(yīng)高效而有序地進行;
(5)
介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接;
質(zhì)膜參與形成具有不同功能的細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)。
2
膜蛋白
雖動物細(xì)胞主要有9種膜脂,而膜蛋白的種類繁多,多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少,但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。
根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式,膜蛋白可分為兩大類型:外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。
(1)
外在膜蛋白為水溶性蛋白,靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合,因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來,膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。
(2)
內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密,一般講只有用去垢劑(detergent)使膜解后才可分離出來。
獲得大量有生物學(xué)活性的質(zhì)膜蛋白對我們顯得非常的重要。

附注:使用分級抽提方法獲得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具備多跨膜區(qū)的整和膜蛋白,膜蛋白,到目前為止,仍然是蛋白組學(xué)的一個瓶頸,不管采用2-D技術(shù)也好,ICAT乃至proein microarray都還不能有效解決這一問題。

二、蛋白抽提
談及蛋白分離,我們想到:超速離心,鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法……有時這些方法常常組合到一起對特定的物質(zhì)進行分離純化。由于蛋白質(zhì)種類繁多,不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異,其溶解度也各不相同.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性,同時可選擇不同的溶劑提取,分為水溶液提取和有機溶劑提取.
但是針對膜蛋白的提取與細(xì)胞質(zhì)蛋白,核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等,最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣,一般常用的有膽酸鹽,CHAPS(一種離子去污劑),EmulgenLubrol等表面活性劑。
1、分離膜蛋白的方法(原則性):
1 先分離膜,然后提。蝗邕x用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎,然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。(例如:michael11液氮研磨組織,加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。差速離心。蔗糖密度梯度離心。收集37%41%間的成分,即為質(zhì)膜部分。裂解即可收集膜蛋白
2 )用特殊的去污劑選擇性的分離。 從膜上提取蛋白有許多困難.在多數(shù)情況下,都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來,然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定.去垢劑的選擇通常是依據(jù)他對所需要蛋白質(zhì)的提取效率來確定,但在某些情況下,還要考慮到以后的純化步驟.雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進行純化,但最終仍可能需要除去去垢劑.這常常會引起蛋白質(zhì)失活,但如果蛋白質(zhì)是用于測序的,他將不是一個問題.如果不是用于測序的,可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠.許多文獻和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中,都介紹有許多種不同的可用來溶解膜蛋白的去垢劑.然而,他們并不是普遍適用的.在設(shè)計膜蛋白溶解方案時,必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì). triton X-100280nm處有吸收,如果某蛋白質(zhì)的測試與280nm處的吸收有關(guān),就應(yīng)避免使用這類去垢劑.
將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后,再進一步從細(xì)胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來.這種做法的好處是可以用強烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白,而無需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成分或染色質(zhì)成分的混入.使用這種方法所獲得的膜蛋白,無論在種類上還是數(shù)量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(<5000Da)要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足0.1%,所以充分的膜蛋白的提取,無疑對于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的. 第二種方法簡單,可靠,但有時含有其他蛋白。一般的都是利用4度時所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液,在溫度超過20度時,此溶液分為水相和去污相;此時親水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。
3 )膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP 分離強疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng),一般有去垢劑(如SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(P-端),又具有陽離子鈣(C-端),與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發(fā)現(xiàn),樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換,從而達到分級分離的目的。
層析柱提取 http://www.alomone.com/ (參步驟)
4) 順序抽提法:根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異,用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白;把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)液溶解提取高疏水性蛋白;最后用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液,最后可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。
5)centrifugal protein extraction

原理:高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶漲破裂后,超高速離心
評價:盡管分級(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點.該方法相較MOLLOY MP教授在1998electrophoresis上發(fā)表的分級抽提法減去了第一步(tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡化,總而言之是一種不錯的方法。(codegreen
6)detergent- based:提取時先裂解液裂胞膜(選用不同的去污試劑是關(guān)鍵),梯度離心分離細(xì)胞器(ER),然后分級抽提方法。例如,去掉細(xì)胞器之后的DEBRIS就是核膜,再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時不溶的部分。
總的感受:細(xì)胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白,方便迅速。
到目前為止,提取膜蛋白仍然是蛋白學(xué)的一個瓶頸。

2、分離膜蛋白的方法(操作)

1)分離細(xì)胞膜蛋白的方法:
1 冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中,于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融2次。
2 5000轉(zhuǎn)4度離心,驅(qū)除核及未裂解的細(xì)胞。
3 取上清12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液B中。
4 12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C中提取后測蛋白濃度,SDS-PAGE電泳,分裝后-20度保存?zhèn)溆谩?/span>
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

2)分離細(xì)胞膜蛋白的方法:
1、細(xì)胞放在冰上,去除上清,用pH74的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下單層細(xì)胞,4度下10 000g 5min離心
4、溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相,然后37度下2 000g離心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀,冰浴2min后加溫,在按步驟6再次離心
7、按步驟8再次抽提去污劑相,用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
8、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相,并進行免疫沉淀實驗
試劑:
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HClpH7。5)、蛋白酶抑制劑
2、緩沖液A(含0。5mol/LNaClRIPA buffer
3buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)

3)分離細(xì)胞膜蛋白的方法:
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000個細(xì)胞,可用此 buffer 1ml。 冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速低溫離心30min。
取上清-20保存。

4)分離組織膜蛋白的方法:
1、取組織,加入10ml Buffer A 于冰上充分勻漿。
2、J6-HC離心機800rpm4℃離心10min后,所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。
3、100000g,4℃離心1hr。棄去上清,沉淀用適量的 Buffer B重懸,冰上孵育2hr后分裝至EP管, Eppendorf臺式離心機10000rpm4℃離心30min。
4、收集所得上清液即為膜組份。
Buffer A0.32M 蔗糖,5mM Tris-HClPH 7.5),120mM KCl,1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上預(yù)冷。
Buffer B20mM HEPESPH 7.5),10%甘油,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 冰上預(yù)冷。

5)分離組織膜蛋白的方法:
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧膽酸鈉
0.1%SDS
以下用時加入
10mg/ml PMSF異丙醇(終濃度10ul/ml
Aprotinin30ul/ml
1000mM Sodium Orthovandate10ul/ml

冰凍組織100mg/細(xì)胞1000000個,可用RIPA buffer 1ml。 冰浴勻漿。冰上置30分鐘。
4度高速離心30min,20000轉(zhuǎn)低溫離心最佳。
取上清-20保存。

6)分離細(xì)菌膜蛋白的方法:
20ml 營養(yǎng)肉湯中過夜培養(yǎng)細(xì)菌,37℃,200rpm。
10000g20min、4℃離心,去上清。
20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸,同樣條件離心,再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液。
超聲波破碎細(xì)菌。
3000g,10min、室溫下離心去除未破碎細(xì)菌。小心吸取上清(含有胞質(zhì)成分和細(xì)菌外被成分)。
超速離心I100,000g,60min4℃,去除上清(胞質(zhì)成分),收集細(xì)菌外被成分。
10ml2%的SLSTris-Mg 緩沖液重懸沉淀物,室溫溫育20-30min。
超速離心II70,000g,60min,室溫沉淀收集外膜蛋白,去除上清(含細(xì)胞質(zhì)膜)。重復(fù)⑦、⑧兩步。
充分吸除上清,并根據(jù)沉淀體積大小用0.1-0.2 mlddH2O重懸沉淀物。根據(jù)公式:蛋白濃度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260測定外膜蛋白濃度,調(diào)節(jié)蛋白濃度至40ug/ul,該蛋白質(zhì)樣品-70℃貯存。
試劑
Tris-Mg 緩沖液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3,4℃保存
2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉 (SLS)

7)來源于Methods Enzymology (1974)
1.取一定量酶處理的細(xì)胞,用勻漿器破碎,操作要溫和,使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng),因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強度和滲透壓,以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。
2.用Potter-Elvehiem勻漿器,桿與壁間間隙0.50.6μm,14.4kr/min上下勻漿46次,每次5S。
3.過濾勻漿液,150g離心10min,保留上清,沉淀部分加入50μl介質(zhì),用勻漿器1kr/min勻漿3次,150g離心10min,沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。
4.合并3次上清液,2kg離心10min,棄上清,沉淀部分溶于100μl介質(zhì),離心10min,棄上清,留沉淀。
5.將沉淀部分加入70%蔗糖15份,然后分別置于三個離心管中,上面依次疊加54%、49%、45%,41%,37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6700kg離心90min,分離介質(zhì)在1.161.18之間形成介面。
7.收集d1.161.18g/ml之間的細(xì)胞膜,加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min,洗滌2次。
8.保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中,用于細(xì)胞膜的研究分析

8)常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法:(所有操作都在4攝氏度下進行)
1.在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊,倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊,并將它們置于冰上,重復(fù)上述操作,直至組織碎成1mm3大小的碎片,且無可見的血。
2.加入5倍(體積比)與組織塊體積的緩沖液,再置于冰浴的Dounce氏玻璃勻漿器中,抽研10-20次,勻漿組織。
3.勻漿4攝氏度600g離心10min,上清含細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞溶膠。沉淀中有未破碎的細(xì)胞及細(xì)胞核。棄沉淀。
4.上清4攝氏度8000g離心10min,沉淀線粒體。棄沉淀。
5.上清4攝氏度10000g離心20min,棄上清。
6.用勻漿緩沖液重懸沉淀,繼續(xù)勻漿,再次4攝氏度,10000g離心20min,棄上清。
7.用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。
8.粗制的樣品可于干冰/乙醇中速凍,保存于-80攝氏度。

9)用特殊的去污劑選擇性的分離。簡單,可靠,但有時含有其他蛋白。
原理:4度時所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液,但在37度時,此溶液分為水相和去污相;此時親水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。
方案
1、放射性標(biāo)記受試細(xì)胞
2、將標(biāo)記的細(xì)胞放在冰上
3、去除上清,用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次
4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5、刮下單層細(xì)胞,4度下10 000g 5min離心
6、溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相,然后37度下2 000g離心5min
7、收集水相留作分析
8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀,冰浴2min后加溫,在按步驟6再次離心
9、按步驟8再次抽提去污劑相,用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
10、用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相,并進行免疫沉淀實驗
試劑:
12%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HClpH75)、蛋白酶抑制劑
2)緩沖液A(含0。5mol/LNaClRIPA buffer
3buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)

10)植物中:高度純化的質(zhì)膜是質(zhì)膜蛋白研究的基礎(chǔ),制備純化方法也很多,植物材料中以1蔗糖密度梯度離心、2水溶性雙水相法、3自由流電泳等方法為主。前兩種常用。1的產(chǎn)率較高但純度不高,220世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種分離高純度質(zhì)膜的方法,經(jīng)多次雙水相分配即可得到高純度質(zhì)膜,近些年此方法廣泛用于植物質(zhì)膜的純化。

 

 

 

 
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