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尋找差異表達(dá)基因方法--簡化SSH法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

無論是從一個(gè)胚胎細(xì)胞分化為不同的組織器官,或者是從正常的組織突變?yōu)槟[瘤組織,都可能涉及在同一基因組背景下不同基因的差異性表達(dá)。尋找差異表達(dá)的基因就有可能揭示細(xì)胞分化的機(jī)制或者腫瘤的成因,因而也就成為一項(xiàng)熱門的技術(shù)。

尋找差異表達(dá)的基因有不少方法,抑制消減雜交(SSH)是比較有效的一種方法。以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit為例:將樣品(tester)和對(duì)照(driver)的mRNA分別反轉(zhuǎn)錄并合成為雙鏈cDNA后進(jìn)行酶消化;樣品(tester)分為兩組,分別加上不同的adaptor1/2;再將兩組樣品(tester)分別與過量的對(duì)照(driver)雜交,兩份雜交結(jié)果混合,加入過量的對(duì)照再進(jìn)行第二輪雜交;補(bǔ)齊adaptor然后用PCR選擇性擴(kuò)增。由于過量的對(duì)照封閉了在樣品中共同表達(dá)的基因,而在樣品中特異表達(dá)的基因會(huì)被選擇性地?cái)U(kuò)增出來,這些擴(kuò)增的片斷經(jīng)過克隆、測序后可以進(jìn)行拼接或者用RACE的方法從已知片斷釣全長cDNA,再做進(jìn)一步的分析。

但是這一系列的操作并不簡單,且得到的結(jié)果是一些基因片斷,還需要進(jìn)行下一步的拼接或RACE才能得到完整的基因信息,現(xiàn)在介紹一種簡化的消減雜交的技術(shù):以Miltenyi Biotec公司的μMACS mRNA Isolation Kit為例,在純化對(duì)照(driver)mRNA時(shí)先將組織裂解,加入耦聯(lián)了Oligo dT的磁珠懸液,混勻并立即加入放在磁場中的磁式分離柱中,磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并懸浮在磁場中,其它雜質(zhì)隨溶液流出。加入新鮮的wash buffer反復(fù)淋洗干凈掛上mRNA的磁珠后,不用洗脫液洗脫mRNA,而是利用磁珠上的Oligo dT作為RT引物直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),再用Elution buffer洗脫mRNA,得到耦聯(lián)在磁珠上的對(duì)照單鏈cDNA庫。這時(shí)將樣品(tester)的mRNA加入磁珠中,共同表達(dá)的基因?qū)?yīng)的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁場中而特異表達(dá)的mRNA不被吸附隨溶液流出柱外,這部分溶液反復(fù)過柱后得到的就是差異表達(dá)的mRNA。其它的mRNA分離試劑也可有類似的用法,只是本文介紹的方法由于得到的mRNA純度高、完整且濃度高體積小,又是層析柱式的逐級(jí)淋洗使cDNA與mRNA吸附得更充分,所以假陽性較少。

這種方法得到的是全長的mRNA,可以直接得到全長的cDNA而無需拼接DNA片斷,且操作也較為簡單。至于效率或假陽性率則因人而異了。

 

 

 

 
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