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RNA干擾研究前沿和應(yīng)用領(lǐng)域

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

小RNA(MicroRNA,miRNA)的作用與應(yīng)用研究繼2001,2002連續(xù)兩年被美國(guó)《Science》雜志評(píng)選為年度10大突破技術(shù)以來(lái),2003年繼續(xù)熱度高漲,名列前矛。其核心技術(shù)RNA干擾(RNAi),即用20多個(gè)核苷酸組成的短的雙鏈RNA(siRNA)代替?zhèn)鹘y(tǒng)反義核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默,已經(jīng)迅速而廣泛地應(yīng)用到基因功能,基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等熱門領(lǐng)域,并為基因治療開辟了新的途徑。近兩年來(lái),這方面的科學(xué)論文及報(bào)道爆炸性增長(zhǎng),幾乎每天都有新的結(jié)果涌現(xiàn)。此外,RNAi沉默機(jī)制的探索方面也取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。在大致勾畫出生物體內(nèi)源性小RNA的重要作用框架后,2003年生物學(xué)家致力于闡述更進(jìn)一步的細(xì)節(jié),探索小RNA如何調(diào)控細(xì)胞的行為,如何利用RNAi機(jī)制進(jìn)行疾病防治等等。以下就分幾個(gè)方面為大家介紹一些近幾年RNA干擾的主要研究領(lǐng)域及前沿進(jìn)展。

一. 外源RNA誘導(dǎo)RNAi的應(yīng)用

1. 基因功能研究
  從2001年《Nature》雜志上首家報(bào)道在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中通過siRNA成功誘導(dǎo)了特異性靶基因表達(dá)沉默后,RNA干擾技術(shù)就作為一項(xiàng)特異性基因沉默的有效工具從低等生物成功進(jìn)軍哺乳動(dòng)物領(lǐng)域。2003年Rubinson DA等又在Nature Genetics上報(bào)道用病毒系統(tǒng)在原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞,干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠上都取得了RNA干擾成功,更大大擴(kuò)展了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍。研究者們可以利用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特異性地表達(dá)沉默,通過觀察其表達(dá)被抑制后細(xì)胞以至生物體從形態(tài)到各項(xiàng)生理生化的變化,對(duì)該基因的功能及參與的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。這比傳統(tǒng)的基因敲除方法要簡(jiǎn)單而且方便得多,因此短短幾年,就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相關(guān)的一些基因,不僅對(duì)疾病機(jī)制及相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí),也為基因治療及藥物篩選提供了一些借鑒。
  在具體誘導(dǎo)方式方面,目前報(bào)道的成功的siRNA形式多樣,其中短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA,short hairpin RNA)表達(dá)載體的應(yīng)用大大加快了研究者從最初的培養(yǎng)細(xì)胞水平擴(kuò)展到成體水平的步伐。例如,在神經(jīng)生物學(xué)研究中,美國(guó)NIH的Backman C等通過siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)中腦腹側(cè)神經(jīng)細(xì)胞中的多巴胺能相關(guān)基因進(jìn)行了有效抑制, Hommel JD等還通過病毒介導(dǎo)的RNAi建立了此類成年小鼠模型,不僅為建立神經(jīng)系統(tǒng)的功能缺失模型找到了一些有價(jià)值的表型標(biāo)記,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療也有一定借鑒意義;在癌癥研究中,Zhang Y等也通過shRNA表達(dá)載體成功抑制成年大鼠腦癌基因,并對(duì)RNAi的遠(yuǎn)程(穿過血腦屏障)基因沉默方法進(jìn)行了非常有益的探索;利用細(xì)胞凋亡途徑,Zender L等通過RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率,并發(fā)現(xiàn)Caspase 8 siRNA處理對(duì)特異性Fas 激活劑(Jo2和AdFasL)和野生型腺病毒介導(dǎo)的急性肝功能衰竭都有效,表明這個(gè)動(dòng)物模型能反應(yīng)人類急性病毒肝炎多分子參與的機(jī)制,增強(qiáng)了siRNA用于急性肝炎病人治療的希望……
除了對(duì)某些關(guān)鍵基因的RNAi研究外,Zheng L等還在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中探索了siRNA在基因組水平上的篩選方法。他們建立了一個(gè)包含8000多個(gè)基因的siRNA表達(dá)框文庫(kù)陣列,通過它來(lái)高通量篩選NF-kB信號(hào)途徑中已知的及Unique基因。由此可見,RNA干擾也正作為篩選成百甚至上千基因的工具,發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。
  總的來(lái)說,RNA干擾為系統(tǒng)地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相對(duì)簡(jiǎn)便的途徑。通過在一段時(shí)間內(nèi)對(duì)一個(gè)基因RNA信號(hào)的抑制,研究者可以深入研究基因功能,進(jìn)而開始描繪支配從細(xì)胞形態(tài)到信號(hào)系統(tǒng)的遺傳網(wǎng)絡(luò)。

2. 基因治療及藥物篩選探索
  由于RNA干擾是針對(duì)轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默,相對(duì)于傳統(tǒng)基因治療對(duì)基因水平上的敲除,整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)便,且作用迅速,效果明顯,為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制,控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。尤其針對(duì)引起一些對(duì)人類健康嚴(yán)重危害的核酸病毒,如去年在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行的SARS這種主體是單鏈核酸的新型冠狀病毒,尋找藥物靶點(diǎn),設(shè)計(jì)核酸藥物就更加方便。目前已經(jīng)有很多公司在積極開發(fā)這方面的藥物,如在去年SARS藥物研究中一鳴驚人的美國(guó)俄勒岡州的AVI BioPharma生物制藥公司等。國(guó)內(nèi)也有很多研究機(jī)構(gòu)及生物技術(shù)公司投入了這方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻關(guān)領(lǐng)導(dǎo)小組,其中生化細(xì)胞所和藥物所的一些課題組在從RNA干擾的角度努力。此外,北大,中南大學(xué),北京動(dòng)物所等大專院校研究機(jī)構(gòu)以及北京金賽獅反義核酸技術(shù)開發(fā)有限公司等也開展了RNA干擾藥物的研究與開發(fā)。
  基因治療方面去年最引人注目的進(jìn)展之一是對(duì)肝炎的RNA干擾研究。McCaffrey AP等通過表達(dá)shRNA的載體在培養(yǎng)細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒后免疫活性缺失的小鼠肝臟中成功抑制了HBV復(fù)制。與對(duì)照相比,小鼠血清中測(cè)得的HBsAg下降84.5%,免疫組化對(duì)HBcAg的分析結(jié)果下降率更超過99%。另,哈佛大學(xué)Lieberman的研究小組通過注射針對(duì)Fas的siRNA,過度激活炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞自身混亂。然后給測(cè)試小鼠注入使Fas hyperdrive的抗體,發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行siRNA處理的對(duì)照組小鼠在幾天中死于急性肝功能衰竭,而82%的siRNA處理小鼠都存活下來(lái),沒有患病,它們當(dāng)中80-90%的肝細(xì)胞經(jīng)證實(shí)結(jié)合了siRNA。并且,RNAi發(fā)揮功能達(dá)10天,三周后才完全衰退。由于Fas很少在肝細(xì)胞外的其它細(xì)胞高表達(dá)水平,對(duì)它的抑制對(duì)其它器官幾乎沒有副作用。 此外,這個(gè)小組還和其它研究者積極開展針對(duì)HIV的RNAi測(cè)試,目前報(bào)道他們使用的針對(duì)CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV進(jìn)入免疫細(xì)胞約三周,在已經(jīng)感染的細(xì)胞中也能阻止感染病毒的復(fù)制。
  然而,盡管取得了不少成果,要真正用于醫(yī)療還需時(shí)日。目前大多數(shù)還停留在小鼠測(cè)試階段,siRNA的導(dǎo)入多采用靜脈或腹腔注射,尾部注射,細(xì)胞移植等,如何對(duì)人進(jìn)行有效的給藥,既能確保藥效在靶器官靶組織有效釋放,還要具有高度安全性等等問題都尚需進(jìn)一步研究。我們期待著RNAi引領(lǐng)的新醫(yī)學(xué)革命的到來(lái)
在藥物篩選領(lǐng)域,除了線蟲這種低等動(dòng)物的RNAi高通量藥篩模式外,2003年Lavery KS等的綜述中也對(duì)RNAi在藥篩領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了高度評(píng)價(jià):RNAi技術(shù)將逐漸成為藥物靶點(diǎn)篩選和鑒定的強(qiáng)大工具。他對(duì)如何在藥篩的各個(gè)階段應(yīng)用RNAi做了具體描述及展望,并指出將這項(xiàng)技術(shù)與高通量篩選,體外生物檢測(cè)和體內(nèi)疾病模式相結(jié)合,將提供大量基因功能方面的有用信息,在藥物開發(fā)過程的多個(gè)階段促進(jìn)靶點(diǎn)的篩選。

二. 內(nèi)源RNAi機(jī)制及功能研究
  是什么原因使我們有可能通過外源siRNA誘導(dǎo)內(nèi)源性的靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默?為解開這個(gè)迷題,更有效地進(jìn)行RNAi應(yīng)用,隨著RNAi應(yīng)用研究的廣泛開展,生物體內(nèi)部RNAi機(jī)制研究也愈加深入,并迅速成為RNAi研究中的重要領(lǐng)域,吸引著越來(lái)越多的研究者投身其中,涌現(xiàn)出一系列令人耳目一新的成果。
  多年來(lái),生物學(xué)家認(rèn)為RNA在生命過程中的作用僅僅是將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白,就象蜂群中的雄蜂般沒有創(chuàng)意。但近幾年的一系列發(fā)現(xiàn)使研究者對(duì)RNA,尤其是mRNA以外的哪些小RNA的功能有了全新的認(rèn)識(shí)。生物體中有一群小RNA(目前看來(lái)人體中編碼約255種小RNA,竟占整個(gè)基因組近1%,很多可能編碼自以前被認(rèn)為“垃圾DNA”的區(qū)域),它們也可通過自身的RNAi機(jī)制,在生命過程的各個(gè)階段關(guān)閉或調(diào)控基因表達(dá)水平,從而控制細(xì)胞的多種生命活動(dòng)。尤其在發(fā)育過程中2003年有一些激動(dòng)人心的最新發(fā)現(xiàn):僅約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小RNA,發(fā)現(xiàn)竟能引導(dǎo)早期發(fā)育――從使植物葉片成形到介導(dǎo)果蠅胚胎在植物組織中的細(xì)胞增殖;缺少RNAi蛋白Dicer(一種RNA酶III家族的酶,參與RNAi過程中對(duì)RNA的剪切)的小鼠會(huì)缺少干細(xì)胞的某些分化系(swaths of stem cells),在出生前就夭折;小鼠中特定的小RNA能幫助引導(dǎo)干細(xì)胞生成胚胎的血細(xì)胞系統(tǒng)。
  此外,有些RNAi現(xiàn)象能在DNA編碼不變的情況下傳代,甚至在一些物種中對(duì)基因組進(jìn)行調(diào)整,有人形象地比喻它為“引導(dǎo)基因組的手”,生動(dòng)體現(xiàn)了小RNA源于基因組但對(duì)基因組所具有的強(qiáng)大反饋?zhàn)饔!禨cience》上一篇題為“RNAi Extends Its Reach”的綜述詳細(xì)闡述了RNAi途徑已經(jīng)不僅僅限于沉默mRNA,還作用于基因組。這方面的具體機(jī)制還不是非常明確,但在植物中發(fā)現(xiàn)伴隨有DNA甲基化現(xiàn)象,科學(xué)家們預(yù)測(cè)要描繪一張完整的RNA引導(dǎo)基因組改變的圖譜可能需要對(duì)RNA信號(hào),DNA甲基化和組蛋白修飾之間的相互作用進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。
綜合來(lái)看,我們可將目前報(bào)道的內(nèi)部RNAi機(jī)制可能的功能,大致分為以下幾類:

1. 抗病毒功能
  Voinnet和Li等分別在植物和果蠅中發(fā)現(xiàn)了通過RNAi實(shí)現(xiàn)的抗外源核酸機(jī)制:被大多數(shù)RNA病毒啟動(dòng)的RNAi可導(dǎo)致病毒基因組降解。例如在果蠅細(xì)胞中, Flock house virus (FHV)就能引發(fā)果蠅內(nèi)部的RNAi反應(yīng),產(chǎn)生FHV特異性的siRNA來(lái)降解感染的FHV。

2. 基因調(diào)控
  目前在人、蠕蟲,果蠅和植物等生物體中都發(fā)現(xiàn)了小RNA,有的通過結(jié)合3’非翻譯區(qū)(UTR )和靶mRNA抑制mRNA翻譯,有的作為siRNA通過RNAi機(jī)制破壞靶基因轉(zhuǎn)錄本,對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。

3. 染色質(zhì)濃縮
  內(nèi)源的siRNA,一些小RNA可能通過使染色質(zhì)濃縮調(diào)節(jié)基因表達(dá)。一些研究小組發(fā)現(xiàn)dsRNA結(jié)合到植物啟動(dòng)子區(qū)域能通過一種使DNA甲基化的作用導(dǎo)致基因沉默;在蠕蟲體內(nèi)檢測(cè)到許多Polycomb 蛋白(能結(jié)合染色質(zhì))是RNAi過程所必須的;裂殖酵母中內(nèi)源siRNA可介導(dǎo)中心粒區(qū)染色質(zhì)濃縮,導(dǎo)致這個(gè)位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄沉默。如Vera Schramke等在裂殖酵母中通過合成shRNA反式抑制同源位點(diǎn),導(dǎo)致在mate區(qū)沉默的Swi6染色質(zhì)濃縮。這些結(jié)果都提示一些內(nèi)源性的siRNA通過導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮來(lái)調(diào)節(jié)基因水平。

4. 轉(zhuǎn)座子沉默
  目前,兩方面的證據(jù)提示轉(zhuǎn)座子沉默涉及siRNA。其一,發(fā)現(xiàn)蠕蟲mut-7基因參與RNAi和轉(zhuǎn)位抑制。其二,從裂殖酵母的中心粒區(qū)也分離出siRNA,并檢測(cè)到這些siRNA介導(dǎo)此區(qū)內(nèi)組蛋白甲基化。由于中心粒區(qū)包含重復(fù)序列――含轉(zhuǎn)座子片段,在一些減數(shù)分裂基因中也發(fā)現(xiàn)了通過其附近的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR(長(zhǎng)末端重復(fù)序列)介導(dǎo)的RNAi,推測(cè)在siRNA介導(dǎo)的中心粒區(qū)域的組蛋白甲基化可能源于古老的轉(zhuǎn)座子沉默作用。

5. 基因組重組
  siRNA可能參與纖毛蟲,四膜蟲蟲體間結(jié)合時(shí)的基因重組。結(jié)合到重組序列的siRNA,在蟲體之間的結(jié)合過程中介導(dǎo)DNA缺失和染色體斷裂。有趣的是,在這些siRNA介導(dǎo)的程序性DNA刪除事件中,也發(fā)現(xiàn)需要重組區(qū)域組蛋白的甲基化。

 

 

 
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