原理和應(yīng)用:
Ettan DIGE熒光差異蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上,結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒,在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品,并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念,極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性,可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中,每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo),并且軟件全自動(dòng)根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn),保證所檢測(cè)到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。DIGE技術(shù)可檢測(cè)到樣品間小于10%的蛋白表達(dá)差異,統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95%以上。利用Ettan DIGE技術(shù)還可以對(duì)微量(少到5μg)樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,例如激光捕獲顯微切割(LCM)得到的樣品或者很難獲得的珍貴樣品等。
Ettan DIGE系統(tǒng)包括CyDye DIGE熒光標(biāo)記物,IPGphor II/Ettan DALT電泳系統(tǒng),Typhoon多功能激光共聚焦掃描儀和DeCyder差異分析軟件。CyDye DIGE熒光標(biāo)記物專門為Ettan DIGE系統(tǒng)設(shè)計(jì),這些熒光標(biāo)記物是分子量和電荷匹配的,具有信號(hào)強(qiáng),光譜分開,吸收和發(fā)射峰窄等特點(diǎn)。這些特點(diǎn)使不同的CyDye(Cy2, Cy3, Cy5)標(biāo)記的樣品可以在同一塊膠上共分離,保證所有樣品在完全相同的第一向和第二向電泳條件下分離,消除實(shí)驗(yàn)的偏差并保證精確的膠內(nèi)匹配。利用IPGphor II進(jìn)行第一向分離和Ettan DALT垂直電泳儀進(jìn)行第二向分離,在一塊2-D膠上同時(shí)分離多達(dá)3個(gè)樣品。Typhoon的光學(xué)系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化,在Ettan DIGE系統(tǒng)的CyDye DIGE熒光標(biāo)記蛋白成像中能達(dá)到高靈敏度,并且其控制軟件經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)采集Ettan DIGE圖像。全自動(dòng)多色熒光掃描功能可以一次檢測(cè)多個(gè)樣品并做到四色熒光一次成像,既保證了分析準(zhǔn)確性又提高了通量。另外,Typhoon除了能檢測(cè)范圍廣泛的熒光素外,還有經(jīng)過驗(yàn)證的磷屏同位素檢測(cè)和直接化學(xué)發(fā)光成像功能。特別開發(fā)的軟件DeCyder完全自動(dòng)化進(jìn)行DIGE結(jié)果的多重樣品間的差異比較,并通過內(nèi)標(biāo)對(duì)每個(gè)蛋白點(diǎn)和每個(gè)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該軟件全自動(dòng)定位和分析在一塊膠中的多重樣品,并進(jìn)行多塊膠之間的比較分析,得到精確的蛋白豐度差異變化的計(jì)算結(jié)果。利用DeCyder軟件可以得到統(tǒng)計(jì)學(xué)可信的結(jié)果,極大降低操作者之間的偏差,并且將手工操作時(shí)間減少到幾分鐘。
采用DIGE技術(shù),通過對(duì)不同類型,不同個(gè)體的細(xì)胞、組織、或經(jīng)過不同處理和不同生長(zhǎng)條件下蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析,在研究疾病的分子機(jī)理、分子診斷、藥物作用機(jī)理、毒理學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。尤其是通過對(duì)各種疾病組織和正常組織進(jìn)行比較,可以得到針對(duì)特定疾。ɡ缒[瘤)的一些標(biāo)記蛋白質(zhì),得到的這些蛋白質(zhì)可以用來作為疾病分子診斷的標(biāo)記,或?yàn)檫M(jìn)一步的疾病治療以及藥物開發(fā)提供有價(jià)值的信息。
Ettan DIGE是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準(zhǔn)確率最高的技術(shù)之一,是已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證并且被許多著名的蛋白質(zhì)組學(xué)研究部門肯定的技術(shù)。Ettan DIGE技術(shù)已經(jīng)在各種樣品中得到應(yīng)用,包括人、大鼠、小鼠、真菌、細(xì)菌等,主要用于功能蛋白質(zhì)組學(xué),如各種腫瘤研究,尋找疾病分子標(biāo)志物,揭示藥物作用的分子機(jī)制或毒理學(xué)研究等方面。