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親和層析

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

(一)原理

親和層析是一種吸附層析,抗原(或抗體)和相應(yīng)的抗體(或抗原)發(fā)生特異性結(jié)合,而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原(或抗體)固相化后,就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體(或抗原)選擇性地結(jié)合在固相載體上,借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開,達(dá)到分離提純的目的。

此法具有高效、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。

(二)載體的基本要求和選擇

理想的載體應(yīng)具有下列基本條件:①不溶于水,但高度親水;②惰性物質(zhì),非特異性吸附少;③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化;④理化性質(zhì)穩(wěn)定;⑤機(jī)械性能好,具有一定的顆粒形式以保持一定的流速;⑥通透性好,最好為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使大分子能自由通過;⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中,皂土、玻璃微球等吸附能力弱,且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強(qiáng)。聚丙稀酰胺凝膠是目前的首選優(yōu)良載體。

瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng),理化性質(zhì)穩(wěn)定,不受細(xì)菌和酶的作用,具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時(shí),對蛋白質(zhì)幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化,活化后性質(zhì)穩(wěn)定,能經(jīng)受層析的各種條件,如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h~3h及蛋白質(zhì)變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理,不引起性質(zhì)改變,故易于再生和反復(fù)使用。

瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose,含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松,而吸附容量比2B大,所以4B應(yīng)用最廣。

(三)試劑與配制

1.Sepharose 4B

2.CNBr(劇毒)

3.抗原或抗體

4.1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

5.0.1Mol/L NaHCO3

6.2Mol/L NaOH

7.0.01Mol/L pH7.4 PBS

0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml

0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml

NaCl 32.76g

加水至4 000ml。

8.0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml,取此液,加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

9.7Mol/L尿素

10.0.2Mol/L NaHCO3,(含0.1Mol/L NaCI)

1Mol/L NaHCO3 100.00ml

NaCl 2.93g

加水至500.00ml。

(四)實(shí)驗(yàn)方法

1.瓊脂糖活化

⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌,立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中,冰浴置于磁力攪拌器上。

⑵ 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入瓊脂糖中,小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右,反應(yīng)10min。在1min~2min迅速調(diào)整pH為8.0~11.0維持10min。

⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

2.偶聯(lián)蛋白 20ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。

⑴ 事先將需偶聯(lián)的抗原(或抗體)蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(shí)(一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體)。

⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min內(nèi),從抽洗到偶聯(lián)),4℃緩慢攪拌過夜,使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。

3.裝柱

⑴ 選柱:不宜過大,一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。

⑵ 裝柱:將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi),擰緊下口夾,讓其下沉,數(shù)分鐘后松開下口夾,使溶液約以1ml/min的速度流出。

⑶ 洗柱:以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3(含0.1Mol/L NaCl)洗滌至洗出液的OD280<0.02為止。

收集全部的洗脫液,測得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量,由此可計(jì)算偶聯(lián)率。

4.吸附與解吸附

⑴按床體積1/10加樣,濃度為1%~2%,緩慢加入待純化的抗體(或抗原),用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫,流速為1ml/min,至洗出液OD280<0.02為止。

⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸-HCl緩沖液,流速1ml/min,收集解吸附下來的成分,立即以1Mol/L NaHCO3中和,以免蛋白變性。

5.以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌,再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌,平衡后,可繼續(xù)使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷凍和干裂。

6.結(jié)果判定

⑴ 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進(jìn)行純度鑒定。

⑵ 將純度好的各管洗脫液合并,以生理鹽水透析,然后濃縮或凍干保存。

 

 

 
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