（一）原理
親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達(dá)到分離提純的目的。
此法具有高效、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。
（二）載體的基本要求和選擇
理想的載體應(yīng)具有下列基本條件：①不溶于水，但高度親水；②惰性物質(zhì)，非特異性吸附少；③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化；④理化性質(zhì)穩(wěn)定；⑤機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強(qiáng)。聚丙稀酰胺凝膠是目前的首選優(yōu)良載體。
瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不受細(xì)菌和酶的作用，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時(shí)，對蛋白質(zhì)幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化后性質(zhì)穩(wěn)定，能經(jīng)受層析的各種條件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h~3h及蛋白質(zhì)變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理，不引起性質(zhì)改變，故易于再生和反復(fù)使用。
瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用最廣。
（三）試劑與配制
1．Sepharose 4B
2．CNBr（劇毒）
3．抗原或抗體
4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5．0.1Mol/L NaHCO3
6．2Mol/L NaOH
7．0.01Mol/L pH7.4 PBS
0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml
0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml
NaCl 32.76g
加水至4 000ml。
8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。
9．7Mol/L尿素
10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）
1Mol/L NaHCO3 100.00ml
NaCl 2.93g
加水至500.00ml。
（四）實(shí)驗(yàn)方法
1．瓊脂糖活化
⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。
⑵ 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應(yīng)10min。在1min~2min迅速調(diào)整pH為8.0～11.0維持10min。
⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
2．偶聯(lián)蛋白 20ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。
⑴ 事先將需偶聯(lián)的抗原（或抗體）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(shí)(一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體)。
⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián)），4℃緩慢攪拌過夜，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。
3．裝柱
⑴ 選柱：不宜過大，一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。
⑵ 裝柱：將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。
⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD280＜0.02為止。
收集全部的洗脫液，測得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此可計(jì)算偶聯(lián)率。
4．吸附與解吸附
⑴按床體積1/10加樣，濃度為1％～2%，緩慢加入待純化的抗體（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD280＜0.02為止。
⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。
5．以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷凍和干裂。
6．結(jié)果判定
⑴ 對解吸附下來的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進(jìn)行純度鑒定。
⑵ 將純度好的各管洗脫液合并，以生理鹽水透析，然后濃縮或凍干保存。
