陰離子交換劑與陽離子交換劑的裝柱和層析過程基本相同。交聯(lián)葡聚糖的預(yù)處理只需充分溶脹和平衡,不需要除去細粒碎片和酸堿處理。其他步驟也基本同離子交換纖維素。
1.劑型的選擇 根據(jù)蛋白質(zhì)在所用緩沖液pH值下帶電荷的種類選擇,如pH高于蛋白質(zhì)等電點,應(yīng)選陰離子交換劑,反之應(yīng)選陽離子交換劑。一般情況下,DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白,而CM纖維素用于分離堿性蛋白質(zhì)。
下面以DEAE-纖維素操作為例,介紹試驗方法
2.膨脹活化 此步的目的在于除去雜質(zhì),暴露DEAE-纖維素上的極性基團。DEAE-纖維素的用量則根據(jù)柱容積的大小和所需過柱樣品的量來決定。一般是1.0g DEAE-纖維素相當(dāng)于6ml~8ml柱床體積。
稱取所需的量,撒于0.5Mol/L NaOH溶液中(1g DEAE—纖維素干粉約需15倍NaOH液),浸泡1h左右,不時攪拌。抽濾(以布氏漏斗加兩層濾紙或尼龍紗布抽濾),以蒸餾水洗滌,再抽濾,直至濾液近中性為止,再將纖維素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h,同樣抽濾液至近中性。再將纖維素浸于0.5Mol/L NaOH液中,同樣處理,洗至中性。
3.平衡 將DEAE—纖維素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中(即起始緩沖液),靜止1h,不時攪拌,待纖維素下沉后,傾去上清液或抽濾除去洗液,如此反復(fù)幾次至傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時為止。
4.裝柱 層析柱的選擇要大小、長度適當(dāng)。一般而言,柱長和柱直徑之比為10︰1~20︰1,柱的內(nèi)徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內(nèi)浸泡處理24h,然后依次用常水、蒸餾水、起始緩沖液充分洗滌。
裝柱時,先剪一塊圓形的尼龍紗布(直徑與層析柱內(nèi)徑一致),放入層析柱底部。將柱下端連接細塑料管,夾上螺旋夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上,倒入起始緩沖液至一半的柱高,除去死區(qū)及塑料管內(nèi)的氣泡。再將平衡的DEAE-纖維素糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產(chǎn)生氣泡,如有氣泡應(yīng)排除或重裝。擰開螺旋夾,使流速至1ml/5min,待緩沖液快接近纖維素面時,繼續(xù)倒入纖維素糊,同時用玻璃棒攪拌表面層,以免使兩次加入的纖維素形成分界層,通過進出緩沖液調(diào)節(jié)流量,也可通過塑料管的升降來控制,至柱床體積不變?yōu)橹。剪一圓形濾紙(與柱內(nèi)徑大小一致),從柱的上端輕輕放入,使其沉接于纖維素床表面,以免在加樣時打亂纖維素層。裝好柱的柱面應(yīng)該是平整的,無傾斜,整個柱床內(nèi)無氣泡、不分層。繼續(xù)平衡,使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。
5.上樣 要層析的樣品首先必須用起始緩沖液(4℃)平衡過夜,中間可換液數(shù)次。將柱的上端打開,用吸管將纖維素柱上面的緩沖液吸出,不要吸凈,留一薄層液面,以免空氣進入。沿管壁緩緩加入樣品,注意不要打亂纖維素表層。擰開下端的螺旋夾,使樣品進入交換劑中,快要進完時,加1ml~2ml緩沖液沖洗柱壁,隨即用多量的洗脫液洗脫。
樣品的加量與DEAE—纖維素有一個最適比的關(guān)系,超過這個比值,吸附就不完全,直接影響到分離的純度。經(jīng)過粗提的 —球蛋白50mg~100mg,用干重約4g DEAE-纖維素裝柱分離,可獲得理想結(jié)果。
6.洗脫 對于陰離子交換劑而言,洗脫的辦法是使pH逐漸降低,而離子濃度逐漸升高。一般的辦法,是穩(wěn)定一個因素而改變另一個因素洗脫。洗脫可采用分段洗脫和連續(xù)洗脫法,前者較實用,后者較準確。
7.洗脫液的收集 利用自動分步收集器收集,并以20%磺基水楊酸測試,當(dāng)?shù)鞍滓合聛頃r,開始分管收集,至無蛋白液為止。
8.交換柱的再生 將使用過的DEAE-纖維素移入燒杯中,用2Mol/L NaCl液浸泡,抽濾并洗滌數(shù)次。如不立即使用,可加1/10 000的疊氮鈉防腐,保存于4℃冰箱中。使用時,再以堿-酸-堿處理。