蛋白質(zhì)組研究的發(fā)展以雙向電泳技術(shù)作為核心. 雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個(gè)E.coli蛋白，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化. 雙向電泳原理簡(jiǎn)明，第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離，至各自的等電點(diǎn)；隨后，再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離. 目前，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，已能分離出10 000個(gè)斑點(diǎn)(spot). 當(dāng)雙向電泳斑點(diǎn)的全面分析成為現(xiàn)實(shí)的時(shí)候，蛋白質(zhì)組的分析變得可行.
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關(guān)2-DE的成效，目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯(lián)合有協(xié)同作用. 對(duì)IEF(isoelectric focusing)樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來(lái)完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質(zhì). 理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉(zhuǎn)換. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵，增強(qiáng)了蛋白的溶解度，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)至第二向的增加］. 兩者通過(guò)不同的方法來(lái)增加蛋白的溶解度，作為互補(bǔ)試劑會(huì)更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內(nèi)切酶去除核酸(DNA). 除此之外，機(jī)械力被用來(lái)對(duì)蛋白分子解聚，如超聲破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過(guò)程中加樣，覆蓋整個(gè)IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失］. 此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能，代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn). 亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)、提高加樣量(已達(dá)到1～15 mg級(jí)的標(biāo)準(zhǔn))、應(yīng)用敏感性檢測(cè)，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來(lái)分析和檢測(cè). 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點(diǎn). 由于堿性pH范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流(EOF)的產(chǎn)生，對(duì)PI(等電點(diǎn))超過(guò)10的堿性蛋白，通過(guò)產(chǎn)生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯酰胺來(lái)增加基質(zhì)的穩(wěn)定性. ?
2-DE面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復(fù)性允許進(jìn)行凝膠間配比(match). 對(duì)2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O(shè)’Farrell’s技術(shù)為基礎(chǔ). 第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholyte, CA)，在管膠內(nèi)建立pH梯度. 隨著聚焦時(shí)間的延長(zhǎng)，pH梯度不穩(wěn)，易產(chǎn)生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài)，堿性蛋白會(huì)離開(kāi)凝膠基質(zhì)而丟失. 因此，在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發(fā)展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出現(xiàn)解決了pH梯度不穩(wěn)的問(wèn)題. IPG通過(guò)immobiline共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點(diǎn)，從而達(dá)到高度的重復(fù)性. 目前可以精確制作線性、漸進(jìn)性和S型曲線，范圍或?qū)捇蛘膒H梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯(lián)合商品化的pH 4～7的梯度可對(duì)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測(cè)策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應(yīng)的線性、飽和閾/動(dòng)態(tài)范圍、敏感性、對(duì)細(xì)胞蛋白群的全體定量分析的適應(yīng)性、可行性. 目前，沒(méi)有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術(shù). 銀染已成為一種檢測(cè)2-DE的流行方法，可檢測(cè)少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍(lán)R-250敏感. 多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色，一些有機(jī)染料不適于PVDF膜. 放射性標(biāo)記不依賴其代謝的活性，并僅適于對(duì)合成的蛋白質(zhì)檢測(cè). 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè)，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級(jí)進(jìn)行檢測(cè).
較早期相比，2-DE有兩個(gè)主要的進(jìn)步：首先，極高的重復(fù)性使有機(jī)體的參考圖譜，可通過(guò)Internet獲得，來(lái)比較不同組織類型、不同狀態(tài)的基因表達(dá)；其次，高加樣量使得2-DE成為一項(xiàng)真正的制備型技術(shù).
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關(guān)2-DE的成效，目標(biāo)是盡可能擴(kuò)大其溶解度和解聚，以提高分辨率. 用化學(xué)法和機(jī)械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯(lián)合有協(xié)同作用. 對(duì)IEF(isoelectric focusing)樣品的預(yù)處理涉及溶解、變性和還原來(lái)完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質(zhì). 理想的狀態(tài)是人們應(yīng)一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉(zhuǎn)換. 三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP )取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內(nèi)的二硫鍵，增強(qiáng)了蛋白的溶解度，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)至第二向的增加］. 兩者通過(guò)不同的方法來(lái)增加蛋白的溶解度，作為互補(bǔ)試劑會(huì)更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內(nèi)切酶去除核酸(DNA). 除此之外，機(jī)械力被用來(lái)對(duì)蛋白分子解聚，如超聲破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性. 由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過(guò)程中加樣，覆蓋整個(gè)IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失］. 此外，低豐度蛋白(low abundance protein)在細(xì)胞內(nèi)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能，代表蛋白質(zhì)組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰(zhàn). 亞細(xì)胞分級(jí)和蛋白質(zhì)預(yù)分級(jí)、提高加樣量(已達(dá)到1～15 mg級(jí)的標(biāo)準(zhǔn))、應(yīng)用敏感性檢測(cè)，可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術(shù)來(lái)分析和檢測(cè). 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點(diǎn). 由于堿性pH范圍內(nèi)凝膠基質(zhì)的不穩(wěn)定及逆向電滲流(EOF)的產(chǎn)生，對(duì)PI(等電點(diǎn))超過(guò)10的堿性蛋白，通過(guò)產(chǎn)生?0～10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯酰胺來(lái)增加基質(zhì)的穩(wěn)定性. ?
2-DE面臨的挑戰(zhàn)是高分辨率和重復(fù)性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復(fù)性允許進(jìn)行凝膠間配比(match). 對(duì)2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O(shè)’Farrell’s技術(shù)為基礎(chǔ). 第一向應(yīng)用載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholyte, CA)，在管膠內(nèi)建立pH梯度. 隨著聚焦時(shí)間的延長(zhǎng)，pH梯度不穩(wěn)，易產(chǎn)生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達(dá)到平衡狀態(tài)，堿性蛋白會(huì)離開(kāi)凝膠基質(zhì)而丟失. 因此，在等電區(qū)域的遷移須在平衡狀態(tài)之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發(fā)展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized pH gradient, IPG)的出現(xiàn)解決了pH梯度不穩(wěn)的問(wèn)題. IPG通過(guò)immobiline共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點(diǎn)，從而達(dá)到高度的重復(fù)性. 目前可以精確制作線性、漸進(jìn)性和S型曲線，范圍或?qū)捇蛘膒H梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯(lián)合商品化的pH 4～7的梯度可對(duì)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點(diǎn)檢測(cè)(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測(cè)策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的. 此外，還需考慮反應(yīng)的線性、飽和閾/動(dòng)態(tài)范圍、敏感性、對(duì)細(xì)胞蛋白群的全體定量分析的適應(yīng)性、可行性. 目前，沒(méi)有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術(shù). 銀染已成為一種檢測(cè)2-DE的流行方法，可檢測(cè)少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍(lán)R-250敏感. 多數(shù)糖蛋白不能被考馬斯亮藍(lán)染色，一些有機(jī)染料不適于PVDF膜. 放射性標(biāo)記不依賴其代謝的活性，并僅適于對(duì)合成的蛋白質(zhì)檢測(cè). 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個(gè)樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個(gè)，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級(jí)進(jìn)行檢測(cè).
較早期相比，2-DE有兩個(gè)主要的進(jìn)步：首先，極高的重復(fù)性使有機(jī)體的參考圖譜，可通過(guò)Internet獲得，來(lái)比較不同組織類型、不同狀態(tài)的基因表達(dá)；其次，高加樣量使得2-DE成為一項(xiàng)真正的制備型技術(shù).
