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RFLP操作要點

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06
 一、 材料
  基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
  二、設備
  電泳儀及電泳槽, 照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊,吸水紙若干,尼龍膜(依膠大小而定),濾紙 ,eppendorf管(0.5ml)若干。
  三、試劑:
  1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
  2、5×TBE電泳緩沖液:配方見第一章。
  3、變性液:0.5mol/L NaOH,1.5mol/L NaCl 。
  4、中和液:1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
  5、10×SSC:配方見第九章。
  6、其它試劑:0.4mol/L NaOH,0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ,ddH2O,Agarose 0.8%, 0.25mol/L HCl 。
  四. 操作步驟
  1. 基因組DNA的酶解
  (1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。
  (2) 在50μl反應體系中,進行酶切反應:
    5μg基因組DNA
    5μl 10×酶切緩沖液
    20單位(U)限制酶(任意一種)
    加ddH2 O, 至50μl
  (3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應過夜。
  (4) 取5μl反應液,0.8%瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底,這時不應有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。
  [注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應一定要徹底。
  2. Southern轉移
 。1) 酶解的DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。   
 。2) 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。   
  (3) 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉至中和液中和30分鐘。
 。4) 預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。也可用電轉移或真空轉移。
 。5) 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
 。6) 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時。
 。7) 探針的制備和雜交見第九章分子雜交部分。
  [注意] 1、 步驟(2)中脫嘌呤時間不能過長。
      2、 除步驟(1)、(4)、(5)外, 其余均在搖床上進行操作。
      3、步驟(4)中,當尼龍膜覆于膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時也不應有氣泡發(fā)生。
      4、有時用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異,這時應該試用另一種酶。
 

 

 
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