1.臨用之前制備羥胺溶液,置冰上待用。
2.將用氯化銫純化的10μg質(zhì)粒DNA加到含500μl羥胺溶液的微型離心管。
3.在37℃下培養(yǎng)20小時(shí)。
4.加入10μl的5mol/L NaCl、50μg 1mg/ml的牛血清蛋白(BSA)和1ml無(wú)水乙醇終止反應(yīng),置-70℃沉淀DNA10分鐘。
5.離心10分鐘,小心棄去所有上清液,收集DNA。
6.將DNA懸浮于100μl TE緩沖液(pH8)中,再加入10μl 3mol/L的醋酸鈉和250μl的無(wú)水乙醇,在-70℃下放置10分鐘,重復(fù)步驟5,收集DNA。
7.讓沉淀自然干燥,再懸浮于100μl TE緩沖液(pH8)。
8.該DNA可直接用于大腸桿菌或酵母的轉(zhuǎn)化。誘變DNA與非誘變DNA相比,酵母的轉(zhuǎn)化頻率相對(duì)降低約3倍。在大腸桿菌中,Ura-質(zhì)?杀粰z出。