本法反應(yīng)溫和,對(duì)抗原、抗體免疫活性影響小,已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低,一般為20~40%。
1.原理此法是利用乳過氧化物酶(Lactoperoxidase)有促進(jìn)微量過氧化氫對(duì)125I-的氧化作用,生成125I ,并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。
2.方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。
。1)反應(yīng)液組成:蛋白質(zhì)2~5μg溶于磷酸緩沖液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
(2)在室溫保溫7min;
。3)加入H2O2200ng(10μl);
(4)過7min再加入H2O2(3μl);
(5)保溫7min后,加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng);
。6)10min后加入NaI載體溶液1ml ;
。7)按常規(guī)方法分離純化。
3.注意事項(xiàng)
。1)LPO質(zhì)量好壞,可直接影響標(biāo)記率,LPO應(yīng)在使用前新鮮配制,以防酶活性降低。
。2)LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%,以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。
。3)碘化反應(yīng)速率分析表明,酶的催化速度很快。
。4)碘化反應(yīng)在pH4.0~8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行,最適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。
。5)H2O2應(yīng)保持低濃度,如高于0.1mmol/L,對(duì)酶的活性將有抑制作用。
1.原理此法是利用乳過氧化物酶(Lactoperoxidase)有促進(jìn)微量過氧化氫對(duì)125I-的氧化作用,生成125I ,并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。
2.方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。
。1)反應(yīng)液組成:蛋白質(zhì)2~5μg溶于磷酸緩沖液10~25μl中,加入Na125i 1m Ci(10μl)、乳過氧化物酶溶液25ng(10μl)、H2O2200ng(10μl);
(2)在室溫保溫7min;
。3)加入H2O2200ng(10μl);
(4)過7min再加入H2O2(3μl);
(5)保溫7min后,加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng);
。6)10min后加入NaI載體溶液1ml ;
。7)按常規(guī)方法分離純化。
3.注意事項(xiàng)
。1)LPO質(zhì)量好壞,可直接影響標(biāo)記率,LPO應(yīng)在使用前新鮮配制,以防酶活性降低。
。2)LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%,以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。
。3)碘化反應(yīng)速率分析表明,酶的催化速度很快。
。4)碘化反應(yīng)在pH4.0~8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行,最適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。
。5)H2O2應(yīng)保持低濃度,如高于0.1mmol/L,對(duì)酶的活性將有抑制作用。