對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)行克隆篩選時(shí)，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點(diǎn))。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤(rùn),讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí),固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)塹奶秸朐詠弧?BR> 3.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動(dòng)濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號(hào)的強(qiáng)度和清晰度。
(4) 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時(shí)用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時(shí)用42℃)下,預(yù)雜交1-2小時(shí)。
(5) 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
(6) 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時(shí)應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號(hào)面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個(gè)不對(duì)稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對(duì)應(yīng)。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號(hào)的位置,同時(shí)在不對(duì)稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記。可從底片上取下透明紙,通過對(duì)比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點(diǎn))。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細(xì)菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤(rùn),讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí),固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)塹奶秸朐詠弧?BR> 3.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動(dòng)濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號(hào)的強(qiáng)度和清晰度。
(4) 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時(shí)用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時(shí)用42℃)下,預(yù)雜交1-2小時(shí)。
(5) 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
(6) 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時(shí)應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時(shí)。此時(shí)已可進(jìn)行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號(hào)面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個(gè)不對(duì)稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對(duì)應(yīng)。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時(shí)。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號(hào)的位置,同時(shí)在不對(duì)稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記。可從底片上取下透明紙,通過對(duì)比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。
