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雙鏈DNA探針隨機引物合成法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06
    隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應(yīng)的優(yōu)點是:(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應(yīng)時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進行反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg探針。(4)隨機引物反應(yīng)還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
  材料:待標記的DNA片段。
  設(shè)備:高速臺式離心機,恒溫水浴鍋等。
  試劑:
  (1)隨機引物(隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA)。
  (2)10×隨機標記緩沖液:900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
  (3)Klenow片段。
  (4)20mmol/L DTT。
  (5)未標記的dNTP溶液:dGTP、dCTP和dTTP溶液,各5mmol/L。
  (6)[α-32 P] dATP:比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
  (7)緩沖液A:50mmol/L Tris·Cl (pH7.5); 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0); 0.5% SDS。
  操作步驟:
  (1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf管內(nèi),水浴煮沸5分鐘后,立即置于冰浴中1分鐘。
  (2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內(nèi)混合下列化合物:
    20mmol/L DTT 1μl
    未標記的dNTP溶液 1μl
    10×隨機標記緩沖液 1μl
    [α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
    ddH2O 1μl
  (3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。
  (4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16小時。
  (5) 在反應(yīng)液中加入10μl緩沖液A后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
 

 

 
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