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Northern blot

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-05

  在RNA凝膠電泳之前,先用乙二醛等變性劑處理RNA,再在適宜條件下電泳使充分變性的RNA直接吸印到硝酸纖維膜上。固定后除去變性劑,然后進行雜交。

  試劑:
  乙二醛:4mol/L(約為30%),經(jīng)過陰陽離子交換樹脂純化,使pH為5.5~6.0
  磷酸緩沖液:80mmol/L pH6.5~7.0
  磷酸緩沖液:10mmol/L pH6.5~7.0
  Tris-HCl:20mmol/L pH7.8
  二甲基亞砜:分析純
  20×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉,3mol/l NaCl

  1.RNA變性 吸取1μl 80mmol/L磷酸緩沖液,1μl RNA樣品(最多100μg),2μl,4mol/l 乙二醇,4μl二甲基亞砜;靹蚝螅50℃水浴1h,然后放入冰中。
  2.電泳 變性結(jié)束后,加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸緩沖液2μl和少量溴酚藍(lán),混勻后點樣于1.0%的凝膠上,以4~5V/cm電壓電泳。凝膠電泳液為10mmol/L磷酸緩沖液,pH6.5~7.0。
  3.轉(zhuǎn)移 變性處理后的RNA可以轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維膜上,轉(zhuǎn)移過程和轉(zhuǎn)移變性與DNA相同。
  4.固定 用20×SSC轉(zhuǎn)移RNA。膜夾在兩層干凈濾紙中涼干后,80℃烤膜2h
  5.乙二醛附加物消除 RNA膜固定后,放入20mmol/l Tris-HCl中,100℃處理5~10min,去除乙二醛,然后進行雜交。

 

 

 

 

 
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