1．DNA的變性　DNA變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會使核酸降解。一般認(rèn)為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0）下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調(diào)pH到7～8[亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%）來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。

　　2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定　硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。

　　3．預(yù)雜交　濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預(yù)熱至60。C的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA）。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68。C水浴保溫3~12h。當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68。C時(shí)，在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對于保證濾膜表面充分浸潤預(yù)雜交液很重要。

　　4．雜交　從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口，雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。

　　5．洗膜　取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動）。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。

　　洗膜的溫度一般應(yīng)控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 0.41x(G C) %）。雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。

　　6．結(jié)果顯示　固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計(jì)數(shù)法。前一種方法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影、定影即可。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強(qiáng)曝光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于打點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號的強(qiáng)弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2～5ml閃爍液，剪2～3塊無樣品膜塊作為本底對照。在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動計(jì)數(shù)。液體計(jì)數(shù)測定放射性強(qiáng)度也可在放射自顯影之后進(jìn)行。