含質(zhì)粒的E. Coli cells經(jīng)LB培養(yǎng)液250ml擴(kuò)大培養(yǎng),倒入50ml離心管,4℃,3000rpm,離心15分鐘。棄去上清液。(棄去液丟棄前應(yīng)作消毒處理,以免污染環(huán)境)。加lysis buffer(50mmol/L Glucose,10mmol/l EDTA,25mmol/l Tris-HCl,pH8.0)1-2ml使之懸浮。放置室溫5分鐘,加3.5-7ml新配制SDS/NaOH溶液(1mol/l NaOH 8ml,20%SDs 2ml,蒸餾水30ml)上下?lián)u勻,置冰水浴5分鐘。禁用混勻器,以免DNA分子斷裂),加2.5mol/L醋酸鉀緩沖液(pH4.8)2.6-5.2ml,上下?lián)u勻,冰浴5分鐘。4℃,3000rpm,離心15分鐘。沉淀蛋白質(zhì)。取上清液,加無水乙醇12-24ml(上清液的二倍)放室溫15分鐘后,10000rpm離心,棄上清液。加約為沉淀物體積的0.4倍TE(10mmol/l Tris-Hcl pH8.0,10mmol/l EDTA)溶解沉淀后,加0.2倍的7.5mol/L醋酸銨?捎没靹蚱骰靹颍帽10分鐘。4℃,10000rpm離心5min,棄上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5,10mmol/l EDTA緩沖液,1/10體積的5mg/ml RNase,37℃,30分鐘保溫。加等量的phenol(酚)/CIAA(480ml氯仿,20ml異戊醇),混勻。4℃,10000rpm,離心5分鐘。取上層液加酚/CIAA重復(fù)一次。取上層液加1/10體積5mol/l NaCl和2倍無水乙醇,―20℃過夜或―70℃2小時(shí)以上。4℃,10000rpm,離心10分鐘,棄上清液。加80%乙醇不搖動(dòng),直接10000rpm離心,棄上清液,真空干燥。加適量(約200μl)TE溶解。測(cè)定含量后備用。