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液相核酸分子雜交類型

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

1、吸附雜交
(1)HAP吸附雜交,羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法,在液相中雜交后,DNA:DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上,通過離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀,再用緩沖液離心漂洗幾次HAP,然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。

(2)親和吸附雜交:生物素標記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交,雜交物吸附到酰化親和素包被的固相支持物(如小球)上,用特異性抗DNA:RNA雜交物的酶標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應,加入酶顯色底物。這個系統(tǒng)可快速(2h)檢測RNA。

(3)磁珠吸附雜交:Gen-Probe公司最近應用丫啶翁酯(Acridinium
ester)標記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學方法來檢測,探針和靶雜交后,雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠(陽離子磁化微球體)上,溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出,經(jīng)過簡單的漂洗步驟,吸附探針的小珠可用化學發(fā)光測定。

2、發(fā)光液相雜交
(1)能量的傳遞法。Heller等設計用兩個緊接的探針,一個探針的一端用化學發(fā)光基團(供體)標記,另一個探針的一端用熒光物質(zhì)標記,并且這兩個探針靠得很近,兩個靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標記(光發(fā)射標記)。當探針與特異的靶雜交后,這些標記物靠得很近,一種標記物發(fā)射的光被另一種標記物吸收,并重新發(fā)出不同波長的光,調(diào)節(jié)檢測器使自動記錄第二次發(fā)射光的波長,只有在兩個探針分子靠得很近時,才能產(chǎn)生激發(fā)光,因此這種方法具有較好的特異性。

(2)丫啶翁酯標記法。丫啶翁酯標記探針與靶核酸雜交后,未雜交的標記探針分子上的丫啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去,所以雜交探針的化學發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點是檢測的敏感度低(1ng的靶核酸),僅適用于檢測擴增的靶序列,如rRNA或PCR擴增產(chǎn)物。

3、液相夾心雜交
(1)親和雜交
在靶核酸存在下,兩個探針與靶雜交,形成夾心結(jié)構(gòu)。雜交完成后,雜交物可移到新的管或凹孔中,在其中雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上,而雜交物上的檢測探針可產(chǎn)生檢測信號。用生物素標記吸附探針,及125I標記檢測探針。這個系統(tǒng)的敏感性可檢測出4×105靶分子,該試驗保持了固相夾心雜交的高度特異性。

(2)采用多組合探針和化學發(fā)光檢測
第一類探針是未標記的檢測探針和液相吸附探針,它們有50個堿基長,其中含有30個細菌特異序列堿基和20個堿基的單鏈長尾;第二類探針是固相吸附探針,它可吸附在小珠或微孔板上。未標記檢測探針的單鏈長尾用于結(jié)合擴增多體(標記探針),液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上。典型的試驗可有25個不同的檢測探針和10個不同的吸附探針,第一個標記檢測探針上附著很多酶(堿性磷酸酶或過氧化物酶),可實現(xiàn)未標記檢測探針的擴增,使用化學發(fā)光酶的底物比用顯色反應酶的底物敏感。這個雜交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質(zhì)粒抗性的檢測,敏感性能達到檢測5×104雙鏈DNA分子。

4、復性速率液相分子雜交
這個方法的原理是細菌等原生物的基因組DNA通常不包含重復順序,它們在液相中復性(雜交)時,同源DNA比異源DNA的復性速度要快,同源程度越多,復性速率和雜交率越快。利用這個特點,可以通過分光光度計直接測量變性DNA在一定條件下的復性速率,進而用理論推導的數(shù)學公式來計算DNA-DNA之間的雜交(結(jié)合)度。

 

 

 
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