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考馬斯亮蘭法(Bradford法)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
(一)實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲法(Biuret法)和Folin—酚試劑法(Lowry法)的明顯缺點(diǎn)和許多限制,促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法(Bradford法),是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn),因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。
考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合,使染料的最大吸收峰的位置(lmax),由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595,與蛋白質(zhì)濃度成正比。
Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是:
(1)靈敏度高,據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍,其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大,蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù),因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測(cè)定快速、簡(jiǎn)便,只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定,只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程,大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定,且在5分鐘至20分鐘之間,顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。
(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。
此法的缺點(diǎn)是:
(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差,在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g—球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定,主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性,因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算,而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。
(二)試劑與器材
1. 試劑:
(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA),配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。
(2)考馬斯亮蘭G—250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G—250,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85%的磷酸,用水稀釋至1升。
2. 器材:
(1)可見光分光光度計(jì) (2)旋渦混合器 (3)試管16支
(三)操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)方法
(1)取16支試管,1支作空白,3支留作未知樣品,其余試管分為兩組按表中順序,分別加入樣品、水和試劑,即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用無離子水補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G—250試劑,每加完一管,立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈,以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
(2)加完試劑2~5分鐘后,即可開始用比色皿,在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595,空白對(duì)照為第1號(hào)試管,即0.1mlH2O加5.0mlG—250試劑。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時(shí)間浸泡。
(3)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標(biāo),用吸光度值A(chǔ)595為縱座標(biāo),作圖,即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595值,即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50。
2. 微量法
當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)(10-100mg/ml),可將取樣量(包括補(bǔ)加的水)加大到0.5ml或1.0ml, 空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml H2O, 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑仍加5.0ml, 同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29。
 

 

 
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