隨著PCR技術(shù)的發(fā)展,人們在此基礎(chǔ)上建立起了一系列基于基因分離的新技術(shù)新方法。如mRNA差別顯示技術(shù)(DDRT-PCR)、以及進(jìn)一步改進(jìn)的代表性差示分析(RAD),抑制性扣除雜交(SSH)和交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(RSDD)。
差別顯示PCR是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)結(jié)構(gòu),因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人Liang P和Pardee A根據(jù)Poly A序列起點(diǎn)前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征,設(shè)計(jì)合成了12種下游引物,稱3′-錨定引物,其通式為5’-T11MN;同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列,在5′端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶,其中每一條都代表一種特定mRNA種,這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。
差別顯示技術(shù)自1992年建立后,一直在不斷進(jìn)行著改進(jìn)。如在1994年,Ito等對3′端錨定引物的設(shè)計(jì)由固定兩個堿基變?yōu)橐粋堿基固定的引物,這就使原來12種引物減至3種即可(5′T12G,5′T12A,5′T12C),這樣做減少了每個mRNA樣品對逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)種類的需要,并且把由于簡并性引起的某些RNA的代表性差和RNA數(shù)量過多現(xiàn)象降低到最低程度;在隨后的兩年中,研究人員有在3′端引物和5′隨機(jī)引物末端分別加上了限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(如Hind III酶切位點(diǎn)),使得5′端引物條數(shù)改為8條,長度為13bp,而3′端引物則由18個堿基組成。這樣形成的24種引物對,經(jīng)計(jì)算機(jī)同源性分析表明同樣能覆蓋全部mRNA,使實(shí)驗(yàn)簡化,同時(shí)由于引物變長,使cDNA擴(kuò)增更為有效。有的實(shí)驗(yàn)室采用把Bakman公司的kit,其引物5′端為26bp,3′端為31bp,并加上了T3和T7兩端的測序引物,由儀器切割差異條帶后,再次擴(kuò)增,并通過熒光標(biāo)記,用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)出結(jié)果。此外,許多學(xué)者針對該技術(shù)在****作中假陽性高等問題,還從設(shè)計(jì)對照、提取胞質(zhì)RNA、更換放射性標(biāo)記物以及改變PCR反應(yīng)條件等等方面提出了相應(yīng)解決方案,以求這一技術(shù)得到進(jìn)一步完善。
DD-PCR與示差篩選、扣除雜交相比,具有很多優(yōu)點(diǎn):
1)速度快,較易操作;
2)由于PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;
3)可同時(shí)比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異。
盡管差別顯示技術(shù)有以上諸多方面的優(yōu)點(diǎn),但在實(shí)際操作中仍存在一些問題,主要表現(xiàn)在:
1)出現(xiàn)差別條帶太多,假陽性率高達(dá)70%左右,重復(fù)性差,且對高拷貝數(shù)的mRNA具很強(qiáng)的傾向性;
2)擴(kuò)增條帶分子長度較短,一般在110~450bp之間。