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Sanger雙脫氧法測序原理

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
DNA的復(fù)制需要:DNA聚合酶,單鏈DNA模板,帶有3'-OH末端的單鏈寡核苷酸引物,4種dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指導(dǎo),不斷地將dNTP加到引物的3'-OH末端,使引物延伸,合成出新的互補(bǔ)DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸,雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),因它在脫氧核糖的3’位置缺少一個(gè)羥基,故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。如,存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTP(其中一種為α-32P標(biāo)記)的情況下,將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫,即可形成一種全部具有相同的5'-引物端和以ddC殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息,從而將全部C的位置確定下來。類似的方法,在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下,可同時(shí)制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3‘端結(jié)尾的三組長短不一的片段。將制得的四組混合物平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳板上進(jìn)行電泳,每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長的不同得到分離,制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列.
 

 

 
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