質(zhì)譜方法(Mass Spectroscope,MS)是通過正確測定蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量而進行蛋白質(zhì)分子鑒定、蛋白質(zhì)分子的修飾和蛋白質(zhì)分子相互作用的研究。質(zhì)譜儀通過測定離子化生物分子的質(zhì)荷比便可得到相關分子的質(zhì)量。但長期以來，質(zhì)譜方法僅限于小分子和中等分子的研究，因為要將質(zhì)譜應用于生物大分子需要將之制備成氣相帶電分子，然后在真空中物理分解成離子。但如何使蛋白分子經(jīng)受住離子化過程轉(zhuǎn)成氣相帶電的離子而又不喪失其結(jié)構(gòu)形狀是個難題。20世紀70年代，解吸技術的出現(xiàn)成功地將蛋白分子轉(zhuǎn)化成氣相離子。爾后快原子轟擊與其緊密相關的溶液基質(zhì)二次離子質(zhì)譜法使得具有極性的、熱不穩(wěn)定的蛋白分子可經(jīng)受住電離過程。但這些方法僅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代電噴霧電離(ESI)和軟激光解吸(SLD)電離技術的發(fā)展則使得質(zhì)譜方法應用于高分子量蛋白分子的研究。
電噴霧電離(ESI)原理可按電荷殘留模型予以描述，帶電液滴蒸發(fā)，液滴變小，液滴表面相斥的靜電荷密度增大。當液滴蒸發(fā)到某一程度，液滴表面的庫侖斥力使液滴爆炸。產(chǎn)生的小帶電液滴繼續(xù)此過程。隨著液滴的水分子逐漸蒸發(fā)，就可獲得自由徘徊的質(zhì)子化和去質(zhì)子化的蛋白分子。針對電噴霧電離所產(chǎn)生的多電荷狀態(tài)，F(xiàn)enn將多電荷狀態(tài)理解為對分子質(zhì)量進行多次獨立的測量，并基于聯(lián)立方程解的平均方法，獲得對分子質(zhì)量的正確估量，解決了多電荷離子信息的問題，使蛋白分子質(zhì)量測量精度獲得極大的提高，并于1988年首次成功地測量了分子量為40 kD的蛋白質(zhì)分子，精確度達到99.99%。
軟激光解吸(SLD)是指從激光脈沖中獲得能量后，樣品分子以完整的低電荷分子離子釋放，然后由電場加速。運用激光解吸電離蛋白分子時，激光的能量和波長、化學/物理基質(zhì)的吸收和熱傳遞特性，與基質(zhì)中分析物的分子結(jié)構(gòu)之間需要作合理的選擇調(diào)配。Tanaka選用了低能量氮激光和含有膠狀顆粒的甘油作基質(zhì)，成功地測定了高分子量的糜蛋白酶原、梭膚酶-A以及細胞色素。由于Tanaka成功的開創(chuàng)性工作，SLD技術迅速發(fā)展。目前占主導的方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。這一方法是將樣品摻入一種低分子量的結(jié)晶基質(zhì)，基質(zhì)的最大吸收與激光脈沖波長匹配。由于MALDI產(chǎn)生的是低電荷的完整氣相大分子，可用于檢測純度不高的生物分子。MALDI與飛行時間(TOF)聯(lián)合已經(jīng)成為鑒別大分子的重要方法，成為鑒定細胞內(nèi)蛋白組分不可或缺的研究手段。