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液相色譜法簡介

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結(jié)果,而必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對照定性。當(dāng)無純物質(zhì)對照時,定性鑒定就很困難,這時需借助質(zhì)譜、紅外和化學(xué)法等配合。另外大多數(shù)金屬鹽類和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上,引入了氣相色譜的理論與技術(shù),在70年代初建立了高效液相色譜分析法(以HPLC表示)。在常壓下操作的液相色譜,分離一個樣品往往長達(dá)幾小時至幾十小時,因此工作效率很低。人們曾對這種經(jīng)典液相色譜法試用了柱前加壓或柱后減壓的辦法來提高流速,以縮短分離時間,但是結(jié)果失敗了。根據(jù)液相色譜理論,因為隨著載液(流動相)流速的提高,板高則增大,所以柱效會顯著降低。隨著生產(chǎn)技術(shù)的提高,人們制成了細(xì)。<10μm)而高效的填充物,從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小,柱壓降顯著增大,為了得到合理的載液流速,使用了高壓;輸液泵,使流速達(dá)到1~10mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鐘到幾十分鐘時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用,70年代以業(yè)逐步實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現(xiàn)代液相色譜,以區(qū)別于經(jīng)典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經(jīng)典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態(tài)不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。

高效液相色譜所用基本概念:

保留值等色譜分析有關(guān)術(shù)語,以及分配系數(shù)、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致;高效液相色譜所用基本理論:塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相,則速率議程H=A B/? C?。式中:縱向擴(kuò)散項(分子擴(kuò)散項)B/?對板高的影響與氣相色譜不同,由于液相色譜中組分分子在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)Dm僅為氣相色譜中的萬分之一,因此縱向擴(kuò)散項對板高的影響可以忽略不計。于是影響液相色譜的主要因素是傳質(zhì)項Cu。由圖14—可知,氣相色譜(GC)的流動相流速u增大時,板高H顯著增大(即柱效顯著降低),而液相色譜(LC)的流速增大時,板高增大不顯著(即柱效降低不顯著)。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能,此外,氣相色譜的載氣權(quán)數(shù)種,其性質(zhì)差別也不大,對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多,性質(zhì)差別也大,對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要,并且在選擇流動相對應(yīng)注意以下幾點:流動相對樣品有適當(dāng)?shù)娜芙舛,但不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng),也不與固定液互溶;流動相的純度要高(至少分析純)、粘度要小,以免帶進(jìn)雜質(zhì)和組分在流動相中擴(kuò)散系數(shù)下降;流動相應(yīng)與所用檢測器相匹配,不應(yīng)對組分檢測產(chǎn)生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點,還由于它的流動相(載液)種類比氣相色譜的流動相(載氣)多,因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相,從機(jī)時可提高選擇性。此外,液相色譜的餾分比氣相色譜易于收集。便于為紅外、核磁等方法確定化合物結(jié)構(gòu)提供純樣品。由于高效液相色譜法具有以上特點,它適于分離、分析沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量大(大于400)的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機(jī)物和一些無機(jī)物,而這些物質(zhì)占化合物總數(shù)的75~80%。因此它已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物堿、稠環(huán)芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機(jī)化合物以及多種無機(jī)鹽類的分離和分析。但是,高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面,目前還不如氣相色譜法。此外對于氣體和易揮發(fā)物質(zhì)的分析方面也遠(yuǎn)不如氣相色譜法,因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補(bǔ)短,相輔相成。

1.分離原理
凝膠色譜,又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同,其阻滯作用也不同而進(jìn)行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同,它類似于分子篩的作用,但凝膠的孔徑要比分子篩大得多,一般為幾百至幾千埃。色譜柱內(nèi)填充具有一定大小孔穴的凝膠。當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后,不同大小的樣品分子(圖14—2中以黑點表示)隨流動相沿凝膠顆粒(圖14—2中以空心圈表示)外部間隙和凝膠孔穴旁流過,體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻,因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產(chǎn)生部分滲透作用,小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯,因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣,試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先后流出色譜柱,從而實現(xiàn)分離目的。光凝膠色譜采用水溶液作流動相進(jìn),稱為過濾凝膠色譜(HFC),而用有機(jī)溶劑為流動相時,稱為凝膠滲透色譜(GPC)。

2.固定相
凝膠色譜的固定相凝膠,是含有大量液體(一般是水)的柔軟而富于彈性的物質(zhì),是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立柱網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。根據(jù)凝膠的交聯(lián)程度和含水量的不同,分了軟質(zhì)、半硬質(zhì)和硬質(zhì)三種。軟質(zhì)凝膠(如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等)交聯(lián)度低,膨脹度大,容量大,可壓宿,不能用于高壓(使用壓力低于3.5kg/㎝2或更低),主要用于含水體系的常壓凝膠色譜,半硬質(zhì)凝膠(如苯乙烯一二乙烯基苯交聯(lián)共聚凝膠),容量中等,滲透性較高,壓力可用到70kg/㎝2。適用于非水溶劑流動相;硬質(zhì)凝膠(如多孔硅膠、多也玻球等),膨脹度小,不可壓縮,滲透性好,可耐高壓,適于高流速下操作。

3.流動相
在凝膠色譜中,為提高分率效率,多采用低粘度、與樣品折光指數(shù)相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1,2一二氯乙烷、氯仿、水等。

 

 

 
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