限制性核酸內(nèi)切酶：
是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱(chēng)為工具酶。
瓊脂糖凝膠電泳：
是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就可以向陽(yáng)極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線(xiàn)狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA片段。
EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽, (Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對(duì)之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測(cè)。可以檢測(cè)10ng 的DNA。
質(zhì)粒 pCMV-Myc-T10 NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara） EcoR 1和 Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer) 瓊脂糖 TBE或TAE緩沖液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上樣液(6×)：0.25% 溴酚蘭，40％(W/V)蔗糖 水溶液或30％的甘油。 電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等 .
1) 質(zhì)粒DNA的酶解（自提質(zhì)粒pCMV-Myc-T10）
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質(zhì)粒量(ng)
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緩沖液(μl)*
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EcoR1(μl)
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Xho1(μl)
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H2O (μl)
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總體積(μl)
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I
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200
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2
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0
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0
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17-19
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20
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II
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200
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2
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0.5
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0
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15-17
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20
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III
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200
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2
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0.5
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0.5
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14-16
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20
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* 緩沖液隨不同的酶而不同,本實(shí)驗(yàn)用 H buffer。 置于37℃水浴酶解0.5-1小時(shí)。酶解完成后，分別加入10?l 3倍的上樣緩沖液, 然后各取15?l進(jìn)行電泳分析。
2) 瓊脂糖凝膠的制備:
稱(chēng)取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。
3）膠板的制備:
取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條(寬約1cm)，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好梳子。 將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開(kāi)，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開(kāi)的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸） 或TBE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中使用。
4）加樣:
用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)加樣頭。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周?chē)哪z面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣品孔容量約15～20 ul。1 kb DNA ladder（共10條帶）: 在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入6ul 的 1 kb DNA ladder（50ng/ul ）。
5）電泳（帶上手套操作）:
加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳；
建議在80～100V的電壓下電泳；
當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處停止電泳；
將凝膠放入溴化乙啶（EB〕工作液（0.5ug/ml左右）中染色約20min。
為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）。電泳溫度視需要而定，對(duì)大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進(jìn)行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時(shí)，由于膠太稀，最好在4℃進(jìn)行電泳以增加凝膠硬度。
6）觀(guān)察與拍照:
在紫外燈(310nm波長(zhǎng))下觀(guān)察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā)30s左右，肉眼可觀(guān)察到清晰的條帶。在紫外燈下觀(guān)察時(shí)，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷。拍照電泳圖譜時(shí)，可采用快速凝膠成象系統(tǒng)。
對(duì)于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來(lái)說(shuō)，常會(huì)出現(xiàn)兩條電泳帶，一條是（松弛）螺旋狀質(zhì)粒DNA帶，另一條是超螺旋狀質(zhì)粒DNA的帶，以超螺旋狀質(zhì)粒DNA居多，移動(dòng)速度也最快。有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)三條帶，其中一條是因?yàn)橛幸恍┵|(zhì)粒DNA在提取過(guò)程中遭到損傷而線(xiàn)性化，其移動(dòng)速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒DNA之間，所以該條電泳帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質(zhì)粒很好時(shí)，這條帶會(huì)很弱，有時(shí)看不到。
本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒pCMV-Myc-T10經(jīng)EcoR1單酶切后應(yīng)為5.7kb；用EcoR1和Xho1雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA片段，一條是3.8kb，另一條是1.9kb（如下圖）。
