1） 取10ul待測DNA，于一定濃度的瓊脂糖凝膠上進行電泳。(20mL,1.0%凝膠,)
2) 凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多余部分，并在凝膠的一角作一記號, 拍照
記錄電泳結果(拍照時, 凝膠旁放一尺子)。
3) 雜交用膠的制備 (做以下步驟兩組合一)
A． 將凝膠浸沒入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。
B．用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
C．將凝膠浸沒入30mL變性液中30min, 使凝膠變性。
D．將凝膠浸沒入30mL中和液中15min使它被中和。
重復D一次。在制備雜交用膠時準備轉移的平臺、膜、濾紙等(4、5)。
4) 準備DNA從凝膠向膜轉移的平臺
5) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉移膠相同大小，并在尼龍膜一角做一標記。
另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長度(約18cm)足以達到轉移液盒子的底部。
準備10 X SSC 轉移液。
將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后，再浸入10 X SSC 轉移液中。
6）安裝毛細管轉移裝置
A．將長的濾紙放在轉移平臺的頂部，濾紙兩端達到轉移盒的底部，做成虹吸橋。
B．將8 0mL轉移液倒入轉移盒內(nèi)，并濕潤濾紙。
C．將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。
D．用保鮮紙封住凝膠四邊。
E．將浸濕的轉移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。
F．將剩下的3張濾紙小心的放在轉移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一
玻璃板，其上壓一重物。
G．轉移幾小時或過夜(至少4小時)
注意：勿使轉移液干枯。
7)已轉移的DNA與膜交聯(lián)
A．將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。
B．將膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自動交聯(lián)。
C．用蒸餾水短暫的漂洗已交聯(lián)的膜，空氣中干燥。
此膜可在4oC長期保存。
8)DNA探針的制備(略過)
參照生產(chǎn)商提供的實驗方法合成地高辛標記的探針。
9）印跡的預雜交
將適量的預雜交液DIG Easy Hyb在42 oC預熱。
放入印跡膜,在42 oC預雜交30min。
10)準備探針
水煮地高辛標記的探針5min使變性, 并立即放在冰上2min.
11) 加適量的探針到已預熱的雜交液中,混合均勻(避免形成泡沫,影響雜交效果)。
42 oC雜交至少4小時或過夜。
注意: 不要將探針直接加在印跡膜上，而應加在容器一角的預雜交液中
12）印跡膜的沖洗：
A．將雜交液倒出，儲存起來可再次使用。
B． 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室溫搖動洗膜2次,每次5min .
C． 用已預熱的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC搖動洗膜2次,每次15min (用雜交爐).
13)免疫檢測:
A. 用10mL沖洗液洗膜1-5min.
B. 膜在15mL阻斷液中孵育30min
C. 膜和8mL抗體孵育30min
D. 在15mL沖洗液中洗膜2次,每次15min.
E. 在15mL檢測液中平衡2-5min.
14)將膜的有DNA的面朝上,放在保鮮紙上,滴數(shù)滴CSPD ready-to-use 覆蓋膜; 然后,立即
用保鮮紙包裹, 擠掉多余的CSPD ready-to-use,使其均勻平鋪在膜上,沒有氣泡, 但避
免使膜干掉. 室溫孵育5min.
15)在37 oC孵育潮濕的膜10min,增強發(fā)光.
16)用X-光底片將雜交膜進行曝光10-25min.
(發(fā)光性能至少可持續(xù)48小時)
17) X-光底片的沖洗
Agfa 30顯影液顯影(1-5min)---沖水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水沖洗---晾干底片
2) 凝膠用溴化乙錠染色，切掉凝膠四周多余部分，并在凝膠的一角作一記號, 拍照
記錄電泳結果(拍照時, 凝膠旁放一尺子)。
3) 雜交用膠的制備 (做以下步驟兩組合一)
A． 將凝膠浸沒入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脫嘌呤。
B．用蒸餾水短暫洗凝膠2次。
C．將凝膠浸沒入30mL變性液中30min, 使凝膠變性。
D．將凝膠浸沒入30mL中和液中15min使它被中和。
重復D一次。在制備雜交用膠時準備轉移的平臺、膜、濾紙等(4、5)。
4) 準備DNA從凝膠向膜轉移的平臺
5) 將1張待用尼龍膜和3張厚濾紙切成與待轉移膠相同大小，并在尼龍膜一角做一標記。
另1張厚濾紙切成與凝膠相同寬度，長度(約18cm)足以達到轉移液盒子的底部。
準備10 X SSC 轉移液。
將待用尼龍膜用蒸餾水浸濕后，再浸入10 X SSC 轉移液中。
6）安裝毛細管轉移裝置
A．將長的濾紙放在轉移平臺的頂部，濾紙兩端達到轉移盒的底部，做成虹吸橋。
B．將8 0mL轉移液倒入轉移盒內(nèi)，并濕潤濾紙。
C．將凝膠背面朝上置于濾紙搭成的橋上，凝膠與濾紙間避免有氣泡。
D．用保鮮紙封住凝膠四邊。
E．將浸濕的轉移膜置于凝膠的上部，凝膠與膜間避免有氣泡。
F．將剩下的3張濾紙小心的放在轉移膜的上面，并放一疊吸水紙搭在濾紙上，再放一
玻璃板，其上壓一重物。
G．轉移幾小時或過夜(至少4小時)
注意：勿使轉移液干枯。
7)已轉移的DNA與膜交聯(lián)
A．將膜放在浸有10 X SSC的厚濾紙上，有DNA的一面朝上。
B．將膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自動交聯(lián)。
C．用蒸餾水短暫的漂洗已交聯(lián)的膜，空氣中干燥。
此膜可在4oC長期保存。
8)DNA探針的制備(略過)
參照生產(chǎn)商提供的實驗方法合成地高辛標記的探針。
9）印跡的預雜交
將適量的預雜交液DIG Easy Hyb在42 oC預熱。
放入印跡膜,在42 oC預雜交30min。
10)準備探針
水煮地高辛標記的探針5min使變性, 并立即放在冰上2min.
11) 加適量的探針到已預熱的雜交液中,混合均勻(避免形成泡沫,影響雜交效果)。
42 oC雜交至少4小時或過夜。
注意: 不要將探針直接加在印跡膜上，而應加在容器一角的預雜交液中
12）印跡膜的沖洗：
A．將雜交液倒出，儲存起來可再次使用。
B． 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室溫搖動洗膜2次,每次5min .
C． 用已預熱的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC搖動洗膜2次,每次15min (用雜交爐).
13)免疫檢測:
A. 用10mL沖洗液洗膜1-5min.
B. 膜在15mL阻斷液中孵育30min
C. 膜和8mL抗體孵育30min
D. 在15mL沖洗液中洗膜2次,每次15min.
E. 在15mL檢測液中平衡2-5min.
14)將膜的有DNA的面朝上,放在保鮮紙上,滴數(shù)滴CSPD ready-to-use 覆蓋膜; 然后,立即
用保鮮紙包裹, 擠掉多余的CSPD ready-to-use,使其均勻平鋪在膜上,沒有氣泡, 但避
免使膜干掉. 室溫孵育5min.
15)在37 oC孵育潮濕的膜10min,增強發(fā)光.
16)用X-光底片將雜交膜進行曝光10-25min.
(發(fā)光性能至少可持續(xù)48小時)
17) X-光底片的沖洗
Agfa 30顯影液顯影(1-5min)---沖水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水沖洗---晾干底片
