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植物細(xì)胞工程概述

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

所謂細(xì)胞工程,是指以細(xì)胞為基本單位進(jìn)行培養(yǎng)、增殖或按照人們的意愿改造細(xì)胞的某些生物學(xué)特性,從而創(chuàng)造新的生物和物種,以獲得具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物產(chǎn)品。它主要由兩部分構(gòu)成,其一是上游工程,包含細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遺傳操作和細(xì)胞保藏三個(gè)步驟。另一個(gè)則是下游工程,是將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去,以生產(chǎn)生物產(chǎn)品的過程。顧名思義,植物細(xì)胞工程,當(dāng)然就是針對(duì)植物細(xì)胞的細(xì)胞工程了,它是細(xì)胞工程的一個(gè)重要組成部分。
自1904年Hanning成功培養(yǎng)離體胚以來(lái),伴隨著相關(guān)理論與技術(shù)的飛速發(fā)展,植物細(xì)胞工程也取得了巨大的成就,F(xiàn)在,我們已經(jīng)可以利用細(xì)胞融合及DNA重組等現(xiàn)代生物技術(shù)從細(xì)胞和分子水平改良現(xiàn)有品種甚至于組建新品種。1983年轉(zhuǎn)基因植物問世,并于1986年起被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn),美國(guó)APHIS到97年1月31日已批準(zhǔn)多達(dá)兩千五百八十四例田間試驗(yàn)。不僅如此,一些轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)開始進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。從1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成為首例被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物開始,其后截止至1997年1月,美國(guó)已批準(zhǔn)十七例,加拿大十八例,澳大利亞四例,日本七例。我國(guó)農(nóng)業(yè)部也已于97年上半年批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因延熟番茄的商業(yè)化。由此可見,植物細(xì)胞工程將對(duì)我們的生活產(chǎn)生越來(lái)越大的影響,我們應(yīng)對(duì)此加以重視,了解一些新的研究成果及新技術(shù),以求在生物工程這個(gè)二十一世紀(jì)的龍頭產(chǎn)業(yè)中占有一席之地。

植物細(xì)胞工程涉及諸多理論原理及實(shí)際操作技術(shù),首當(dāng)其沖的自然是培養(yǎng)技術(shù),也就是將植物的器官、組織、細(xì)胞甚至細(xì)胞器進(jìn)行離體地、無(wú)菌的培養(yǎng)。它是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作及細(xì)胞保藏的基礎(chǔ)。此類技術(shù)發(fā)展起步較早,相對(duì)而言已比較成熟,各種培養(yǎng)基制備及很多操作方法已經(jīng)基本規(guī)范化。針對(duì)植物的培養(yǎng)主要有植物組織培養(yǎng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)、花藥及花粉培養(yǎng)、離體胚培養(yǎng)以及原生質(zhì)體培養(yǎng)這幾個(gè)大類,每一種都還可可以繼續(xù)細(xì)分為更具體的小類。組織培養(yǎng)首先將外植體分離出來(lái),然后在無(wú)菌及適當(dāng)條件下培養(yǎng)以誘導(dǎo)出愈傷組織,另外在愈傷組織隨外植體生長(zhǎng)一段時(shí)間后還需要進(jìn)行繼代培養(yǎng),以避免代謝產(chǎn)物積累及水分散失等因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、飼養(yǎng)層培養(yǎng)和雙層濾紙植板幾類,它們都是將選定的植物細(xì)胞于適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行培養(yǎng),以得到大量基本同步化的細(xì)胞,為遺傳操作提供材料;ǚ奂盎ㄋ幣囵B(yǎng)主要是使花粉改變正常發(fā)育途徑而轉(zhuǎn)向形成胚狀體和愈傷組織,從而產(chǎn)生單倍體植株。離體胚培養(yǎng)有幼胚與成熟胚培養(yǎng)兩類,通過使用相應(yīng)的培養(yǎng)基使離體胚正常的萌發(fā)生殖,以供研究和操作使用。原生質(zhì)體的培養(yǎng)則是一切利用原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳操作的基礎(chǔ),它是將取得的植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體后進(jìn)行培養(yǎng),具體方法與細(xì)胞培養(yǎng)有一定的相似之處。作為后繼操作的基礎(chǔ),培養(yǎng)技術(shù)的選擇是非常重要的。采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法可以更好地進(jìn)行遺傳操作和保存細(xì)胞,而錯(cuò)誤的選擇是有可能影響結(jié)果甚至導(dǎo)致試驗(yàn)和生產(chǎn)失敗,造成時(shí)間和金錢的浪費(fèi)。

僅僅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)是不夠,要使培養(yǎng)的細(xì)胞能為人類服務(wù),就要對(duì)其進(jìn)行一定的改造,這就涉及到了細(xì)胞的遺傳操作?梢哉f,遺傳操作是整個(gè)細(xì)胞工程中最為重要也最具挑戰(zhàn)性的一環(huán)。它極大的依賴于理論原理、操作技術(shù)以及設(shè)備的發(fā)展。隨著基因組學(xué)的發(fā)展,各項(xiàng)基因組計(jì)劃正在緊鑼密鼓地進(jìn)行,由于DNA序列分析方法的革新,諸如高效毛細(xì)管自動(dòng)化測(cè)序、DNA芯片法以及大規(guī)模平行實(shí)測(cè)法的應(yīng)用大大加快了基因組計(jì)劃的進(jìn)程。擬南芥基因組計(jì)劃將于2004年完成,水稻、番茄和玉米基因組的測(cè)序也正在進(jìn)行。是類計(jì)劃所提供的信息將不斷定位大量有價(jià)值的基因,而最近的研究還表明影響作物產(chǎn)量的可以是單基因的改變而不僅僅是多基因決定。所有這一切的基礎(chǔ)研究都為遺傳操作提供了更多、更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展則使精確、高效的遺傳操作變得更加方便。將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法不斷完善,除了以前經(jīng)常使用的質(zhì)粒載體、病毒載體、轉(zhuǎn)座因子和APC(酵母人工染色體)等途徑外,通過lipoplex\polyplex介導(dǎo)、裸DNA、"基因槍"、超聲波法和電注射法等非病毒方式轉(zhuǎn)換細(xì)胞的方法也開始被廣泛的使用;細(xì)胞融合方法已被不斷的改進(jìn),融合率增大;細(xì)胞誘變也取得了較大的進(jìn)展,誘變方式不斷增加。這些理論和技術(shù)的發(fā)展都為更好的改造細(xì)胞創(chuàng)造了條件。

培養(yǎng)或改造好的細(xì)胞是進(jìn)行研究和生產(chǎn)的基本材料,為了使其不致死亡并盡量保持優(yōu)良的特性,就需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋2。一般是根?jù)細(xì)胞的特點(diǎn),人工創(chuàng)造條件使其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量降低,處于休眠狀態(tài),以抑制增殖和減少變異。作為世界上最大的細(xì)胞庫(kù),ATCC早在92年就已經(jīng)有了三千兩百多個(gè)細(xì)胞系入庫(kù),而且數(shù)量還在不斷增加。此外還有CSH(美)、NCTC(英)、NRRL(英)、KCC(日)等著名的保藏機(jī)構(gòu),國(guó)內(nèi)也有一些較為大型的機(jī)構(gòu),足見各國(guó)對(duì)細(xì)胞保藏的重視。由于植物細(xì)胞有其自身的特點(diǎn),因而其保藏方法不可能與微生物完全相同。通常采用的方法是液氮超低溫保藏方法。這種方法利用液氮的溫度可以達(dá)到零下一百九十六是使度,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一般細(xì)胞新陳代謝作用停止的溫度(零下一百三十?dāng)z氏度)從而使細(xì)胞的代謝活動(dòng)停止,化學(xué)作用隨之消失,達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。操作時(shí)要注意從常溫到低溫的過渡,以使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過膜滲出,避免其產(chǎn)生冰晶而損害細(xì)胞。另外還有低溫凍藏法及其他一些保藏方法,但多用于短期保藏。

細(xì)胞工程的目的,是得到人們所需要的生物產(chǎn)品。要使已經(jīng)改造好的細(xì)胞產(chǎn)生大量具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物,就必須依靠下游加工過程,也就是我們常說的下游工程。它的作用就是大量培養(yǎng)細(xì)胞,并從培養(yǎng)液中分離、精制出有關(guān)的生物化工產(chǎn)品。由于植物細(xì)胞的高度易碎性,對(duì)剪切力的敏感、細(xì)胞有去分化和聚集作用,增殖時(shí)間長(zhǎng)等獨(dú)特性,使其大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)明顯比微生物和動(dòng)物細(xì)胞的發(fā)展緩慢。但通過不懈的努力,現(xiàn)在已經(jīng)具備在2萬(wàn)升規(guī)模的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)煙草細(xì)胞的能力。而日本的三井石化也已經(jīng)在使用七百五十升發(fā)酵罐通過培養(yǎng)植物細(xì)胞而生產(chǎn)紫草寧,且產(chǎn)量較高,可滿足全日本百分之四十上的需要。相信隨著理論以技術(shù)的不斷完善,植物細(xì)胞的大規(guī)模的培養(yǎng)將會(huì)很快的成為一種常規(guī)的生產(chǎn)手段。培養(yǎng)后的培養(yǎng)物經(jīng)過處理后被分離、提純。分離和精制過程所需的費(fèi)用在整個(gè)生產(chǎn)過程中的占有很大的比例,一般為百分之六十,有些甚至高達(dá)百分之八十至百分之九十,而且還有繼續(xù)加劇的取向。因此該過程的落后也可能阻礙細(xì)胞工程的發(fā)展。世界各國(guó)現(xiàn)在已經(jīng)都比較重視這個(gè)問題,英國(guó)早在83年就發(fā)起了生物分離計(jì)劃(BIOSEP),專門研究分離與精制,我國(guó)也曾經(jīng)召開過專門會(huì)議。分離與精制的困難是由于培養(yǎng)液自身的理化特性所決定,這就需要在上游工程時(shí)就考慮到這方面的問題,同時(shí)不斷推出新的分離純化技術(shù)及方法,從而簡(jiǎn)化過程、降低成本,這在實(shí)際生產(chǎn)中是很重要的。

誠(chéng)然,細(xì)胞工程的偉大和神奇確實(shí)令人驚嘆不已,但隨著這一類技術(shù)的迅猛發(fā)展,基因產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用,其安全性已引起了人們的廣泛關(guān)注。雖然從本質(zhì)上來(lái)講,轉(zhuǎn)基因植物和常規(guī)育成的品種是一樣的,兩者都是在原有品種的基礎(chǔ)上對(duì)其一部分進(jìn)行修飾,或增加新特性,和消除原來(lái)的不利性狀,但是,以前所用的有性雜交僅僅局限于種類和近緣種之間,而轉(zhuǎn)基因植物卻大膽突破了這一局限,其外源基因可以來(lái)自植物、微生物甚至動(dòng)物。在這種情況下,人們對(duì)可能出現(xiàn)的新組合、新性狀是否會(huì)影響人類健康和生物環(huán)境還缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。至少?gòu)哪壳皝?lái)說,我們還不可能很精確的預(yù)測(cè)某一個(gè)外源基因在新的遺傳背景中會(huì)產(chǎn)生什么樣的相互作用。并且,轉(zhuǎn)基因植物還可以對(duì)它所在的環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。比如現(xiàn)在應(yīng)用最多的抗除草劑基因就可能通過同屬野生植物異花傳粉而逐漸擴(kuò)散進(jìn)入自然界,從而使雜草的控制變得更加困難;而抗蟲、抗病基因也有可能通過類似的途徑轉(zhuǎn)移到環(huán)境,給野生種群帶來(lái)選擇優(yōu)勢(shì)而變得無(wú)法收拾。雖然現(xiàn)在一般通過生殖隔離(設(shè)置緩沖作物帶和隔離區(qū))來(lái)防止基因漂流至臨近作物,但若進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和推廣時(shí)就會(huì)難于加以控制。另外,轉(zhuǎn)基因作物還可能造成對(duì)微生物的影響,Hoffman等就曾發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜中的基因可轉(zhuǎn)至黑曲霉中,雖然機(jī)制還不明確,但至少存在這個(gè)事實(shí)。自然界中存在著植物病毒間異源重組,病毒的異源包裝(轉(zhuǎn)移包裝)可以改變其宿主范圍。轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的病毒外殼蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中可以包裝入侵的另一種病毒的核酸,產(chǎn)生一種新病毒,雖然在小規(guī)模的田間實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)這種情況,但長(zhǎng)期的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中是否也是怎樣呢?此外,公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的接受性和標(biāo)簽問題得到也是我們應(yīng)該考慮的問題。

由此可見,細(xì)胞工程是一柄雙刃劍,在造福于人類的同時(shí)也可能毀滅人類,甚至整個(gè)地球。這就要求我們?cè)诖罅Πl(fā)展的同時(shí)注意其安全性,不斷完善理論以技術(shù),使其更好地為人類服務(wù)。

 

 

 
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