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SPA技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、簡(jiǎn)稱(chēng)SPA)是細(xì)胞壁抗原的主要成分,幾乎90%以上的菌株均含有這種成分,但不同的菌株含量差別十分懸殊。SPA占整個(gè)細(xì)胞壁蛋白成分的6.7%,通過(guò)胞壁肽聚糖以共價(jià)鍵與之結(jié)合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA

SPA的理化性質(zhì)

SPA是一種蛋白質(zhì),由亮、纈、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門(mén)冬及賴(lài)氨酸等十種氨基酸組成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸,所以無(wú)二硫鍵。紫外光譜和吸收系數(shù)為A275nm %=1.65,等電點(diǎn)為pH5.1。SPA十分穩(wěn)定,用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件,以及加熱煮沸均不影響其活性。其分子量因測(cè)定方法不同而有所差異。

SPA部分理化參數(shù)

分子量

42 000

沉降系數(shù)S 20w(ˊS )

2.10

擴(kuò)散系數(shù)D20W(cm2/s)

4.3×107

Stocks半徑(nm)

5.00

摩擦比f/f,min

2.10

粘度(n) (ml/g)

2.90

Hμggins常數(shù)

0.66

比容V(ml/g)

0.72

SPA的免疫學(xué)性質(zhì)

SPA能與人及多種哺乳動(dòng)物血清IgG分子中的Fc片段結(jié)合,結(jié)合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛;對(duì)大白鼠、綿羊的親和力差;對(duì)馬、犢牛、山羊等無(wú)親和力;對(duì)所有的魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)(除少數(shù)例外)均不能與之結(jié)合。雞的IgG必須與相應(yīng)的抗原形成復(fù)合物才能與SPA結(jié)合,原因可能是AgAb復(fù)合物改變了IgGFc片段的構(gòu)象。

SPAIgG結(jié)合的亞類(lèi)主要是IgG1、IgG2IgG4。

SPA除與IgG結(jié)合外,還能與血清中少量的IgMIgA結(jié)合,SPA菌對(duì)各類(lèi)免疫球蛋白的吸附率:IgG90%98%IgM2%30%,IgA1.5%20%。

出現(xiàn)共沉反應(yīng)的SPAIgG必須有兩個(gè)結(jié)合部位,它們分別在FcFab段上,缺一雖能與SPA結(jié)合,但不出現(xiàn)共沉反應(yīng),這種Fab的參與并非SPA-抗體反應(yīng),F(xiàn)已研究表明,IgGSPA的結(jié)合部位是CH2CH3的交界處。

SPA的生物學(xué)特性

1.免疫原性與過(guò)敏原性 SPA做為免疫原能刺激免疫活性細(xì)胞合成Ig,又能與其相應(yīng)抗體的Fab段結(jié)合呈現(xiàn)抗原抗體的特異性反應(yīng)。SPAIgG注射家兔皮下可引起Arthus樣反應(yīng),還可引起豚鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。SPA體外試驗(yàn),能刺激豚鼠離體回腸收縮。

2.抗吞噬作用 由于IgGFc段結(jié)合點(diǎn)既是lgG調(diào)理活性結(jié)合點(diǎn),又是SPA反應(yīng)點(diǎn)。因此,SPA可與吞噬細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng),結(jié)果抑制了多形核白細(xì)胞的吞噬作用,也可能是SPA阻斷調(diào)理素與吞噬細(xì)胞作用的結(jié)果。

3.固定補(bǔ)體 SPAIgG和免疫復(fù)合物一樣可以固定人和某些動(dòng)物(如豚鼠、豬、狗等)血清中的補(bǔ)體,主要是通過(guò)補(bǔ)體傳統(tǒng)激活途徑。

4.促有絲分裂因子 SPA是一種B細(xì)胞激活劑,固相SPA作用明顯,并不需要T細(xì)胞輔助,可容性SPA作用微弱,必須有T細(xì)胞參與。

5.去封閉作用 固相SPA能部分去除腫瘤病人和帶瘤動(dòng)物血清中的封閉活性,從而降低了血清對(duì)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒的封閉作用。

SPA的應(yīng)用

SPA應(yīng)用很廣,但所有應(yīng)用的原理都離不開(kāi)SPA具有與IgGFc段的結(jié)合能力,主要應(yīng)用方面如下:

1SPA菌的協(xié)同凝集作用

用已知的標(biāo)準(zhǔn)血清,吸附到SPA菌的表面,使之成為吸附抗體的載體,再以此去診斷相應(yīng)的未知抗原而產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒,診斷的抗原可以是顆粒性的,也可以是可溶性的。此種凝集相當(dāng)于反向間接血凝,但省去間接血凝中的抗體純化,紅血球鞣化等復(fù)雜手續(xù),而只需要 SPA菌體及粗制免疫血清即可。所以此法簡(jiǎn)單、快速,特異性敏感性均較滿(mǎn)意。目前已用于許多細(xì)胞和病毒的檢測(cè)及分型。

協(xié)同凝集只適用于檢測(cè)抗原,未見(jiàn)應(yīng)用于檢測(cè)抗體的報(bào)道。

2.作為廣譜第二抗體 SPA代替抗體IgG的第二抗體,有如下優(yōu)點(diǎn):①SPA制備容易,性質(zhì)穩(wěn)定,易純化,對(duì)人和多種哺乳動(dòng)物的IgG都能應(yīng)用,不受種屬限制。而第二抗體的制備比較麻煩,且需多次免疫動(dòng)物,在應(yīng)用上要受同種屬的限制;②SPA的結(jié)合力強(qiáng),相當(dāng)于游離抗體與抗原的結(jié)合力,對(duì)人和兔的親和常數(shù)均為103 L/克分子,結(jié)合后對(duì)IgG的活性無(wú)影響。無(wú)論在0、37、4456幾乎均能立即結(jié)合而無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間的孵育,因此可以縮短試驗(yàn)時(shí)間,第二抗體在較長(zhǎng)的孵育中,出現(xiàn)抗原分解的問(wèn)題也可以得到解決;③SPA容易標(biāo)上125 I、熒光素、辣根過(guò)氧化物酶、鐵蛋白等,因此可與多種技術(shù)相結(jié)合;④在檢查細(xì)胞上的病毒抗原時(shí),第二抗體往往特異性不強(qiáng),會(huì)非特異性地與細(xì)胞膜上的Fc受體結(jié)合。SPA分子高度均一,它不是免疫球蛋白,不受Fc受體影響,所以有較高的抗IgG特異性;⑤用第二抗體做免疫沉淀試驗(yàn)時(shí),必須將抗免疫球蛋白的濃度調(diào)整至等價(jià),才能產(chǎn)生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀,不受此限制,能保證徹底的沉淀;⑥SPAlgG結(jié)合是可逆的,用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、鹽酸(pH2.5)或鳥(niǎo)嘌呤鹽酸鹽等都可以使之重新解離。

3.用于提取純化IgG 利用SPAIgG的結(jié)合特性提取IgG,比常規(guī)采用硫酸銨、Sephadex柱,DEAE柱或免疫梯度離心等法要簡(jiǎn)便得多,而且純度好。

4.檢測(cè)和提純IgM IgM在病毒的早期診斷中具有重要意義,為了檢測(cè)特異性IgM抗體,必須首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的辦法,利用此法也為IgM的提純開(kāi)辟了道路。

5.其它方面 用于免疫復(fù)合物的檢測(cè)、體外激活補(bǔ)體功能試驗(yàn)、細(xì)胞表面標(biāo)記以及腫瘤表面抗原的檢測(cè)等。

 

 

 
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