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EAC玫瑰花環(huán)試驗

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

原理

B淋巴細胞表面具有補體C3受體,紅細胞可與相應(yīng)的抗體(溶血素)結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物(EA),以紅細胞作為指示細胞,通過補體傳統(tǒng)途徑活化補體,而產(chǎn)生活化的C3,然后與活化的C3結(jié)合形成花環(huán),以供計數(shù)B淋巴細胞。

材料與試劑

1.雞紅細胞懸液的制備 由于綿羊紅細胞易與T淋巴細胞形成E—玫瑰花環(huán),易造成混淆,所以一般在檢測B淋巴細胞時,采用雞紅細胞。從雞翼下靜脈采血,用肝素抗凝,以Hank’s洗滌2次備用。

2.抗雞紅細胞抗體的制備 2kg3kg的健康家兔,以Hank’s液洗過的壓積紅細胞進行免疫,每日背部皮下注射1次,共注5次,注射量為0.5 ml1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml2.5ml。第六次改用靜脈注射50%壓積紅細胞懸液1ml,一日一次,連注3天。末次注射后7天試血,測定紅細胞的凝集效價,以出現(xiàn)“ ”的最高抗血清稀釋度判定為血凝效價。效價達12 000以上者為合格。應(yīng)用時采用凝集價的12(亞凝集價)作為抗血清的稀釋度(即14 000)。

溶血素的效價測定

試驗組

對照組

管號

1

2

3

4

5

6

7

8

溶血素稀釋倍數(shù)

10

102

103

2×103

3×103

4×103

5×103

1 %紅細胞量(ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

溶血素量(ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.9%鹽水(ml

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

混勻,37感作1h

結(jié)果判定

-

-

-

-

3.補體 當(dāng)日采集豚鼠混合血清,用Hank’s液稀釋成1100,置4保存?zhèn)溆谩?/span>

4.無Ca2 Mg2 pH7.2Hank’s

5.姬姆薩染液

61%戊二醛溶液

操作方法

1.分離淋巴細胞,制成約2.5×106個/ml懸液。

2EAC懸液的制備 4%雞紅細胞2ml于試管中,加入14 000的雞溶血素2ml,混勻,置37水浴15min,取出后離心,用Hank’s液洗滌2次,再用Hank’s液恢復(fù)至4%紅細胞2ml,加入等量的1100稀釋補體,混勻,再放置37水浴15min取出,用Hank’s液洗滌2次,配成4EAC細胞懸液。

3.取淋巴細胞懸液0.2ml,加入4EAC細胞懸液0.2ml,混勻,室溫或20作用30min。1 000r/min離心5min,吸棄過多的上清液,放入42h4h。

4.取出后,將沉淀輕輕搖起,加1%戊二醛0.1ml,混勻后置4固定30min

5.以懸液制片,自然干燥,滴加姬姆薩液染2min,加自來水繼續(xù)放置15min,沖洗,將玻片置95%酒精缸脫色15sec~30sec(以脫成淺紫藍色為度),再置鹽酸液缸(按1HCl 1份與自來水2份)脫色(呈淡蘭略帶紅色為度)10sec左右,取出沖洗,干后鏡檢。

結(jié)果判定

凡一個淋巴細胞結(jié)合3個以上雞紅細胞即為EAC花環(huán)形成陽性細胞。共計數(shù)200個淋巴細胞,計算花環(huán)形成率。

注意事項

1.加入淋巴細胞與雞紅細胞的比例一般以140為宜(130150),淋巴細胞過少,花環(huán)形成率明顯減少。

2.淋巴細胞、紅細胞、補體均應(yīng)新鮮,否則花環(huán)形成率明顯下降。

3.據(jù)認為小鼠補體比豚鼠補體更為好,小鼠血清中膠固素活化因子(KAF)含量較多,可使大部分C3裂解而不易引起溶血。

 

 

 
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