原理
混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時,B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上,而多數T細胞則通過尼龍毛柱,這是獲得富含T細胞群的有效方法。
材料及試劑
1.尼龍毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。
2.燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3.裝填尼龍毛柱,一次性注射器。
4.取自然沉降的上層血漿,過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后,獲取的血漿和分層液之間的單個核細胞層。
操作方法
1.尼龍毛的清洗與干燥
(1)戴上已經洗去滑石粉的一次性手套,將尼龍毛(1包或2包,每包35g)放入燒杯中,加入蒸餾水或去離子水,用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
(2)冷卻至常溫,倒入漏斗內,使水滴干。
(3)重復(1)、(2)步驟6次。
(4)將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內,37℃溫箱干燥2~3天后,貯藏在帶蓋的方盤內。
2.裝尼龍毛柱
(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
(2)將尼龍毛梳理,并適當折疊,以適應注射器的直徑,填入注射器內,約20ml的體積。
(3)將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好,高壓滅菌。
3.細胞分離
(1)將注射器固定在支架上,倒入37℃的細胞培養(yǎng)液,關閉閥門一定時間,然后打開閥門,放掉細胞培養(yǎng)液,以清洗幾次尼龍毛,關上閥門。
(2)將要分離的細胞液用預先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當的濃度,約5.00×107個細胞/ml。
(3)將細胞液倒入注射器內,使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器,37℃溫育45min
至1h。
(4)打開下口,緩慢放流(1滴/min),收集于離心管中。
(5)離心,即獲所需的T淋巴細胞。
(6)關閉注射器下口,于注射器內加入0.85%冰冷生理鹽水,振蕩,并套上注射器芯,打開下口,使勁推出注射器內液體,即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞等。
注意事項
1.此種分離法,T淋巴細胞也常有一部分被吸附,吸附的多少與尼龍毛的質量有關,與裝柱的松緊也有關系。
2.此法的T淋巴細胞的回收率約20%~30%。
3.用過的尼龍毛可回收,以鹽水洗滌,然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜,然后再同前法清洗。