若想得到理想的ICC染色結(jié)果、正確地判斷抗原物質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的位置,除需有良好酶和抗體外,保持組織細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的不動性(Immobility)和免疫活性也是至關(guān)重要的。換言之,如果抗原物質(zhì)在組織細(xì)胞間彌散、丟失或失去免疫活性,無論如何努力染色都是徒勞的,所以說固定是ICC染色中非常重要的一環(huán)。ICC與其它組織學(xué)技術(shù)不同,除要求保存良好的結(jié)構(gòu)外,還需保存組織抗原的免疫活性。一般認(rèn)為,新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性,但結(jié)構(gòu)較差,易出現(xiàn)抗原彌散丟失現(xiàn)象。Cumming(1980)報告,不固定的組織切片ICC染色時,環(huán)鳥苷酸含量丟失80%以上。固定的目的是使構(gòu)成組織細(xì)胞成分的蛋白等物質(zhì)不溶于水和有機溶劑,并迅速使組織細(xì)胞中各種酶降解、失活,防止組織自溶和抗原彌散,保持組織細(xì)胞的完整性和所要檢測物質(zhì)的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關(guān)鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多,選擇時應(yīng)根據(jù)所要檢測物質(zhì)的抗原性質(zhì)和切片方法以及所用抗體特征等做最佳篩選。制片及固定方法見第一章 ,下面介紹兩種近年報道的新方法。
1.AMEX(Acetone Meth Enzoate Xylene )法 是改良的冰凍置換法(freeze substitution)的簡稱,主要用于石蠟包埋標(biāo)本。Sato(1986)報告,該法具有同新鮮(未固定)組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結(jié)構(gòu)保存。其機制為:組織在丙酮中固定(脫水),組織細(xì)胞內(nèi)水份逐漸被丙酮取代,繼之,用苯甲酸酯取代組織內(nèi)丙酮,經(jīng)二甲苯置換后,石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內(nèi)過夜亦形成冰晶,所以原方法將組織先置4℃丙酮20~30min,再移入-20℃丙酮過夜。實際上組織在4℃丙酮內(nèi)過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內(nèi)加入少量蛋白酶活性阻斷劑,并采用低溶點石蠟包埋等,可獲得更佳染色結(jié)果。
2.微波固定(Microwave fixation) 為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結(jié)構(gòu)和抗原性,適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機理可能與微波(頻率1000~3000MHz)具有被水分吸收的性質(zhì)(通常所用的微波是頻率2450MHz,波長12cm);生物材料含有大量水份,照射后,溫度升高,分子運動加快,促進固定液向組織內(nèi)滲透,加速與組織成分的反應(yīng),短時間內(nèi)達到固定的效果等有關(guān)。經(jīng)微波照射固定的組織,需置相同固定液中,繼續(xù)固定2~6h,室溫。
近年研究的專門固定用的微波爐已商品化,例如:Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE-2等,該類微波爐能夠準(zhǔn)確地調(diào)節(jié) 照射時間和測定被照材料的瞬時溫度。利用家庭微波爐代替時,應(yīng)選用能以秒為單位調(diào)控的微波爐。實驗材料不同,所需固定液的量、照射時間等各異,所以應(yīng)在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上,找出合適的固定液量、照射時間和溫度。多數(shù)實驗室的條件為:固定液5~10ml,照射10~30s,照射后固定液的溫度≤50。C。其方法為:將實驗標(biāo)本置于微波爐旋轉(zhuǎn)臺的中央,周邊放一燒杯盛300~500ml純水,吸收照射時爐內(nèi)產(chǎn)生的熱量,選擇強擋照射10~30s 。接通電源(on)至微波產(chǎn)生利用超聲波代替微波照射,或二者并用,照射后,組織標(biāo)本和固定液的溫度升高較少,亦能獲得短時間內(nèi)良好的固定效果(Yasuda 1992)。
二、切片
光鏡ICC染色,常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種,二者各有其優(yōu)缺點,應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、實驗室條件,合理選擇之。對未知抗原顯示時,最好同時應(yīng)用。冰凍切片為ICC研究所首選。
Shi(1991)等報告:微波爐照射的切片,能夠激活部分核內(nèi)抗原活性。其機制不清,可能與高溫、高熱的作用,使核內(nèi)DNA雙鏈解開,DNA、RNA解離,抗原暴露有關(guān)。其步驟為:將切片脫蠟水洗后,置染色瓶中,加入去離子水或緩沖液至瓶頸處,反復(fù)多次照射,每次1min,照射5~10次,每次照射后,補充瓶中蒸發(fā)掉的液體,照射溫度不超過90~95℃為宜。此處理后,細(xì)胞核染色以蘇木精為佳