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熒光素標(biāo)記抗體

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

(一) 原理

  目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達(dá)明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴(lài)氨酸的ε氨基共價(jià)結(jié)合,標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光,通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。

  (二) 操作步驟

    將純化的IgG抗體對(duì)PH9~9.5碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜,
    透析后抗體液移入小燒杯中

              ↓

    稱(chēng)取適量IFTC,加入二甲亞砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)
    使終濃度為1mgFITC/1mlDMSO
    FITC/IgG比例:如IgG濃度為1mg/ml,F(xiàn)ITC/IgG比例約為50μgFITC/mgIgG;
    如IgG為5~10mg/ml,則比例為25μgFITC/ml IgG
    在10ml小燒杯中先放入抗體

              ↓

    按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中

           ↓

    將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml,磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h

           ↓

    用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素,先用25ml PBS淋洗G25柱

           ↓

    收集PBS洗脫第一個(gè)熒光素結(jié)合蛋白峰,測(cè)定F/P
    比值。第二個(gè)熒光素峰為游離熒光素

    計(jì)算:

         2.87×A495
    F/P=────────
        A280-0.35×A495

    合適的F/P值為2~4。

  (三) 試劑器材

  1. 純化的多克隆抗體或單克隆抗體。

  2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。

  3. PBS、DMSO

  4. PH9~9.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g,NaHCO3 8.6g加蒸餾水至500ml。

  5. PD10柱(Sephadex G25柱)

  6. 磁力攪拌器,紫外分光光度計(jì)等

  (四) 注意事項(xiàng)

  1. FITC保存于4℃暗處,使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開(kāi)蓋稱(chēng)取,以避免潮解。

  2. FITC-DMSO液要臨用時(shí)配制。

  3. 碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。

 

 

 
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