(一) 原理
目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或羅達(dá)明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴(lài)氨酸的ε氨基共價(jià)結(jié)合,標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光,通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。
(二) 操作步驟
將純化的IgG抗體對(duì)PH9~9.5碳酸鹽緩沖液透析過(guò)夜,
透析后抗體液移入小燒杯中
↓
稱(chēng)取適量IFTC,加入二甲亞砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)
使終濃度為1mgFITC/1mlDMSO
FITC/IgG比例:如IgG濃度為1mg/ml,F(xiàn)ITC/IgG比例約為50μgFITC/mgIgG;
如IgG為5~10mg/ml,則比例為25μgFITC/ml IgG
在10ml小燒杯中先放入抗體
↓
按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中
↓
將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml,磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h
↓
用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素,先用25ml PBS淋洗G25柱
↓
收集PBS洗脫第一個(gè)熒光素結(jié)合蛋白峰,測(cè)定F/P
比值。第二個(gè)熒光素峰為游離熒光素
計(jì)算:
2.87×A495
F/P=────────
A280-0.35×A495
合適的F/P值為2~4。
(三) 試劑器材
1. 純化的多克隆抗體或單克隆抗體。
2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。
3. PBS、DMSO
4. PH9~9.5碳酸鹽緩沖液: Na2CO34.3g,NaHCO3 8.6g加蒸餾水至500ml。
5. PD10柱(Sephadex G25柱)
6. 磁力攪拌器,紫外分光光度計(jì)等
(四) 注意事項(xiàng)
1. FITC保存于4℃暗處,使用前待試劑瓶升至室溫時(shí)開(kāi)蓋稱(chēng)取,以避免潮解。
2. FITC-DMSO液要臨用時(shí)配制。
3. 碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。