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戊二醛二步法制備HRP結(jié)合物

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

  1. 原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。

  2. 標(biāo)記步驟:
  (1) 稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。
  (2) 反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。
  (3) 將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。
  (4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。
  (5) 加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時(shí)。
  (6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置41小時(shí)。
  (7) 3000rpm離心半小時(shí),棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4PBS中。
  (8) 將上述溶液裝入透析袋中,對(duì)0.15M PH7.4PB緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結(jié)合物,分裝后,冰凍保存。

  3. 結(jié)果判定:
  (1) 定性及效價(jià)滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定( 見本節(jié) ()工作濃度的選擇)。
  (2) 定量和克分子比值測(cè)定:可用分光光度計(jì)測(cè)定(光程1cm)。
  酶量(mgml)OD403nm×0.4
  IgG(mgml)OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

         酶量(mgml)   IgG(mgml)   酶量
  克分子比值=──────── ÷ ─────── ─── × 4
          40,000       160,000   IgG

   (3) 本法標(biāo)記步驟比較簡(jiǎn)單,重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低,一般只有24%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

  4. 試劑及器材:
  (1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。
  (2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50mlPH6.8PBS1ml混合。
  (3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml1M碳酸氫鈉7ml混合。
  (4) 0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
  (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
  (6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
  (7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
  (8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
  (9) HRP(RZ>3.0)
  (10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
  (11) 攪拌器,分光光度計(jì),離心機(jī)。
  (12) 透析袋,大、小燒杯,試管,吸管等。
 

 

 
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