按細(xì)胞比重分離B細(xì)胞
1.將2~3ml含3×107純化的B細(xì)胞(B細(xì)胞>90%)的細(xì)胞懸液加到3ml Percoll溶液(比重1.074)上,水平離心1000×g 20分鐘。
2.吸去無(wú)細(xì)胞上清液,交界面的低密度B細(xì)胞和大部分Percoll溶液。由于此時(shí)細(xì)胞沉淀非常松散,需留下約0.2ml Percoll溶液以防吸去了沉淀細(xì)胞。輕敲離心管,用留下的液體懸浮高密度B細(xì)胞。
3.用洗滌液分別洗滌低密度B細(xì)胞和高密度B細(xì)胞兩次,每次離心500×g 10分鐘。最后,測(cè)定細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力,用1~2ml含5%小牛血清的洗滌液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。
用尼龍毛法分離B細(xì)胞
1)尼龍毛柱的制備
1.取直接3D,長(zhǎng)度約10cm的尼龍毛,用0.2mol/L HCl浸泡處理過(guò)夜。用雙蒸水洗凈HCl,置37℃烘干備用。
2.稱取50mg尼龍毛,均勻分散,置Hanks液中浸泡。取1ml注射器,出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中,排凈空氣,柱高約5~6cm。此柱可分離約2×107細(xì)胞。將柱置-20℃可保存2~3個(gè)月。
2)分離細(xì)胞
1.取分離的單個(gè)核細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2×107/0.5ml。
2.融化尼龍毛柱,以每分鐘5~7滴的速度放出Hanks液,并用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。小心將細(xì)胞懸液加入尼龍毛柱中,待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入尼龍毛柱后,立即加0.2ml細(xì)胞培養(yǎng)液,夾住塑料管。
3.在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置1小時(shí)。用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗脫細(xì)胞。洗脫液中含有純的T細(xì)胞。再用5ml預(yù)溫至37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱,洗凈不粘附的細(xì)胞。
4.加入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液,夾住塑料管,將尼龍毛柱置冰箱中冷卻。用4℃預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液分3~4次洗脫尼龍毛柱,每次0.5ml?上葕A住塑料管,用玻璃棒或金屬絲反復(fù)擠壓尼龍毛以利粘附細(xì)胞脫落,然后再洗脫。洗脫液中含有大量B細(xì)胞。離心1000×g 10分鐘,去上清液,用細(xì)胞培養(yǎng)液同樣洗滌細(xì)胞1次。計(jì)數(shù)細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。