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巨噬細胞的分離

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

一、從小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分離巨噬細胞

1.取6周左右的小鼠(或600克左右的豚鼠,或3公斤左右的家兔),剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml(豚鼠20ml,家兔200ml)無菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4%淀粉肉湯。3~4天以后收集腹腔細胞。
2.如要收集腹腔靜置巨噬細胞,不注射刺激物,直接從這一步開始。放血處死動物,以減少腹腔中的紅細胞。消毒腹部,沿腹中線注入3~4ml(豚鼠20~40ml,家兔50~70ml)冰中預冷的無菌PBS-H(含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS)。輕輕按摩腹部5分鐘。
3.以下均無菌操作。剪開腹壁,用吸管吸出滲出液,再用同樣容量的預冷PBS-H沖洗腹腔2~3次。合并滲出液于離心管中,4℃離心250×g 10分鐘,去上清液。
4.用預冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞3次,每次4℃離心250×g 10分鐘,去上清液。用預冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞,臺盼藍染色計數(shù)細胞并決定細胞活力。


二、家兔肺泡巨噬細胞的分離和純化
1.取2~3公斤重的家兔,耳緣靜脈注射10ml空氣處死動物或注射2ml(含130mg)戊巴比妥麻醉動物。仰臥固定,消毒胸部,剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管,分離心臟和血管,取出肺,剪去脂肪和結締組織。用無菌紗布小心擦凈肺表面,稱重。
2.分離肺泡巨噬細胞:用夾子夾住氣管,使肺懸空。向氣管中注射40ml無菌的冷生理鹽水,讓生理鹽水進入全部肺泡。用鑷子提起氣管,從夾子下面剪斷氣管,將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法,用40ml無菌冷生理鹽水沖洗肺泡,合并浸出液,置4℃。
3.分離肺組織中的巨噬細胞:取出肺泡巨噬細胞后,剪去氣管,將肺組織放在有冷RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上,用吸滿冷RPMI-1640培養(yǎng)液的20ml注射器接23號針頭,一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織,直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過00目的鋼絲網(wǎng),分離單個細胞。
4.以下過程均在4℃中進行。分別處理肺泡巨噬細胞和肺組織中的巨噬細胞:離心200×g 10分鐘,去上清液。輕彈試管,懸浮細胞,加入10ml低滲液(20mmol/L Tris, 0.75%氯化銨,pH7.4),37℃處理3~5分鐘,溶解紅細胞。紅細胞通常分別占肺泡巨噬細胞和組織巨噬細胞的1%和10%。也可以不用低滲處理,直接在淋巴細胞分離液上分離巨噬細胞。
5.離心200×g 10分鐘,去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞一次。將細胞懸液加在淋巴細胞分離液(比重1.077)上,離心400×g 20分鐘,收集交界面的巨噬細胞。棄去沉淀的死細胞和紅細胞。
6.用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌巨噬細胞2次。臺盼藍染色檢測細胞活力和細胞數(shù),將細胞配成所需濃度。此時巨噬細胞活力可達90%以上,巨噬細胞占全部細胞的90%以上。

三、從小鼠脾臟、胸腺和骨髓中分離巨噬細胞
1.用外科方法無菌摘取小鼠脾臟和胸腺,置于盛有預冷RPMI-1640培養(yǎng)液(含1%小牛血清)的平皿中,剪去結締組織和脂肪。用無菌注射器芯將脾臟或胸腺擠壓通過200目的鋼絲網(wǎng),獲得單個細胞。
2.離心200×g 10分鐘,去上清液。用含1%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞配成約1×108~5×108/ml。

 

 

 
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