一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點：
�。�1）一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
�。�2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。
（4）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
�。�5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。
�。�6）熒光素不純，標本固定不當(dāng)?shù)取?
二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒�，常用的方法有以下幾種：
�。ㄒ唬﹦游锱K器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
�。�1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。
�。�2）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
�。�3）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。
�。�4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。
�。ǘ┩肝龇�
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸于大于標記物體積約50～100倍的PBS內(nèi)），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
�。ㄈ┢暇厶悄zG-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章 。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4 太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現(xiàn)NH4 ，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時，即進行收集，之后出現(xiàn)SO4 （用1篊l2檢查發(fā)生白色沉淀）。最后是NH4 ，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4 及NH4 后可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
�。ㄋ模〥EAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下：
DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：
�。�1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆�。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
�。�2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。
經(jīng)過DEAE-纖維素層析后的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
�。ㄎ澹晒饪贵w稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
�。┘兓乖�
用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。
�。ㄆ撸┘兓贵w法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
�。ò耍┮廖氖纤{（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/l pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。
組織的非特異性染色的機理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點：
�。�1）一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
�。�2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。
（4）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
�。�5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。
�。�6）熒光素不純，標本固定不當(dāng)?shù)取?
二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒�，常用的方法有以下幾種：
�。ㄒ唬﹦游锱K器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
�。�1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。
�。�2）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
�。�3）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。
�。�4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。
�。ǘ┩肝龇�
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸于大于標記物體積約50～100倍的PBS內(nèi)），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
�。ㄈ┢暇厶悄zG-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章 。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4 太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現(xiàn)NH4 ，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時，即進行收集，之后出現(xiàn)SO4 （用1篊l2檢查發(fā)生白色沉淀）。最后是NH4 ，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4 及NH4 后可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
�。ㄋ模〥EAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下：
DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：
�。�1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強度洗脫液，分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆�。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
�。�2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。
經(jīng)過DEAE-纖維素層析后的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
�。ㄎ澹晒饪贵w稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
�。┘兓乖�
用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。
�。ㄆ撸┘兓贵w法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
�。ò耍┮廖氖纤{（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/l pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。