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流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡——PI單染色法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

基本原理
  其原理主要是根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。這些改變包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等,其中細(xì)胞核的改變最具特征性,主要包括以下幾個(gè)方面:
1. 細(xì)胞核的改變:由于凋亡細(xì)胞核的改變,造成各種染色體熒光染料對(duì)凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明,用各種染色體熒光染料對(duì)經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色,其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。
2. 光散射特性:凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上,前散射光與細(xì)胞的大小有關(guān),而側(cè)散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用,與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí),細(xì)胞固縮,體積變小,故前散射光降低,這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解,核破裂形成,細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多,故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。細(xì)胞壞死時(shí),由于細(xì)胞腫脹,其前散射光增大;側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大,因此可根據(jù)前散射光和側(cè)散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是,根據(jù)前散射光和側(cè)散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中,用光散射特性檢測(cè)凋亡的可靠性較好,而在腫瘤細(xì)胞凋亡中,其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測(cè)凋亡細(xì)胞最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來(lái),用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細(xì)胞亞型。也可用于活細(xì)胞的分類(lèi)。


試劑與儀器
 PBS溶液;
 PI染液:將PI溶于PBS(pH7.4)中,終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。
 70%乙醇
 400目篩網(wǎng)
 流式細(xì)胞儀


實(shí)驗(yàn)步驟
1. 收集細(xì)胞{數(shù)目約(1~ 5)×106個(gè)/mL},500 ~ 1000 r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液。
2. 3ml PBS洗滌1次。
3. 離心去PBS,加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小時(shí)。
4. 離心棄去固定液,3mlPBS重懸5min。
5. 400目的篩網(wǎng)過(guò)濾1次,500—1000r/min離心5min,棄去PBS。
6. 用1ml PI染液染色,4℃避光30min。
7. 流式細(xì)胞儀檢測(cè):PI用氬離子激發(fā)熒光,激光光波波長(zhǎng)為488nm,發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。
8. 結(jié)果判斷:在前散射光對(duì)側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上,凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比,前散射光降低,而側(cè)散射光可高可低,與細(xì)胞的類(lèi)型有關(guān);在分析PI熒光的直方圖時(shí),先用門(mén)技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片,在PI熒光的直方圖上,凋亡細(xì)胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0,則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45,可用雞和鮭魚(yú)的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn),兩者分別為0.35和0.7,可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。


注意事項(xiàng)
  細(xì)胞凋亡時(shí),其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一,但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低,或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時(shí)應(yīng)該注意。

 

 

 
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