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細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

直接培養(yǎng)法
· 原理:直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中,觀察其生長(zhǎng)及菌落生成。
· 特點(diǎn):是目前最直接與靈敏之步驟,亦是用來(lái)評(píng)估其它偵測(cè)新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。
· 缺點(diǎn):培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),須3-5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái) (例如M. hyorhinis)。需同時(shí)培養(yǎng)支原體株作為正反應(yīng)對(duì)照組,可能會(huì)造成污染。
· 材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無(wú)菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無(wú)菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸(厭氧缸長(zhǎng)期培養(yǎng)易有污染,所以厭氧包應(yīng)用無(wú)菌水,每次打開(kāi)厭氧缸后,用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。)
· 培養(yǎng)基制備:基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1:2000)至培養(yǎng)基中以防止其它細(xì)菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) :稱(chēng)取50 g dextrose,10 g L-arginine HCl,溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。分裝100 ml至瓶中,保存于 -70℃。
· 液體培養(yǎng)基 (1 liter) :稱(chēng)取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中,加熱攪拌溶解之。滅菌121℃,15分鐘。待溫度降低至室溫后,于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清,100ml之15% yeast extract solution,及100ml解涷之10x stock solution,混合均勻后,分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中,10ml/管。保存于4℃,期限1個(gè)月。
· 固體培養(yǎng)基 (1 liter ):稱(chēng)取21 g之Difco PPLO broth,0.02 g phenol red,15g Bacto agar于600ml蒸餾水中,加熱溶解之。滅菌121℃,15分鐘。放在50℃水中浴中,待溫度降低至50℃時(shí),于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)加入200ml馬血清,100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution,混合均勻后,倒入60x50㎜之無(wú)菌培養(yǎng)皿中,5ml/培養(yǎng)皿。保存于4℃,期限1個(gè)月。
步驟:
· 取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液,接種于液體培養(yǎng)基中,置于37℃培養(yǎng)二周,觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)一周及二周后,分別取0.1 ml液體培養(yǎng)液涂在agar plate上,將其倒放置于37℃厭氧箱培養(yǎng),培養(yǎng)至少3星期,持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。
· 另取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液,涂抹在agar plate上,37℃厭氧培養(yǎng)3星期,持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。
· 另作正負(fù)反應(yīng)對(duì)照組,正反應(yīng)對(duì)照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負(fù)反應(yīng)對(duì)照組為待測(cè)細(xì)胞之新鮮培養(yǎng)基。
結(jié)果判讀:
· 支原體生長(zhǎng)較慢,所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2周增殖后,再培養(yǎng)于agar plate上。需至少培養(yǎng)3星期后,才可斷定是否有支原體污染。所以整個(gè)測(cè)試需5個(gè)星期才知正確結(jié)果。
· 典型之支原體菌落類(lèi)似荷包蛋(fried- egg like),乃是由于支原體往agar下層生長(zhǎng)所致,為圓形無(wú)色透明菌落,大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落,有些是圓形菌落或是類(lèi)似粘菌類(lèi)形態(tài)(slime)。
· 若要區(qū)分細(xì)胞或是氣泡造成的類(lèi)似菌落,可將其自agar plate上切下,重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)一星期后再種入agar plate,若是細(xì)胞則不會(huì)生長(zhǎng)。

DNA熒光染色法
· 原理︰利用熒光染劑(bisbenzimide, Hoechst 33258)偵測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區(qū)域,因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)(55~80%),所以可將其染色而偵測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后,在細(xì)胞核外與細(xì)胞周?chē)煽吹皆S多大小均一之熒光小點(diǎn),即為支原體之DNA,證明有支原體之污染。
· 測(cè)試步驟用間接步驟,將待測(cè)細(xì)胞懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)液接種于指示細(xì)胞培養(yǎng)液中(indicator cell,例如Vero cell or 3T6 cell),然后培養(yǎng)指示細(xì)胞再作熒光染色。正負(fù)反應(yīng)對(duì)照組亦可以接種于indicator cell內(nèi)作為對(duì)照。
· 待測(cè)細(xì)胞亦可作直接測(cè)試,但需為吸附型細(xì)胞,培養(yǎng)后直接作熒光染色。有些細(xì)胞易有熒光背景,而干擾結(jié)果判讀,則建議使用接種于指示細(xì)胞之步驟。
· 特點(diǎn)︰簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏,廣泛使用,可作為例行之偵測(cè)步驟?梢詡蓽y(cè)不易培養(yǎng)之支原體,例如M. hyorhinis,較直接培養(yǎng)法快,約一星期即可知道結(jié)果。
· 缺點(diǎn):有時(shí)仍會(huì)有熒光背景,影響判讀。
材料︰
· Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物:35 or 60mm sterile plate內(nèi)放置無(wú)菌22x22mm蓋玻片﹙浸于酒精內(nèi),使用前過(guò)火滅菌﹚,一般吸附型細(xì)胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片,細(xì)胞面朝下放在玻片上觀察。
· Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070),細(xì)胞須先測(cè)試無(wú)污染。αMEM with 10鸖 ( medium for Vero cell)
配制試劑:
· 無(wú)菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution,以0.22mm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。
· Hoechst 33258 stock solution(100X)︰稱(chēng)取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無(wú)菌HBSS,置于棕色瓶中,室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后,以1ml分裝至1.5ml小離心管中,貯存于-20℃。
· Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution,加入sterile 100 ml HBSS中,室溫下攪拌45分鐘,置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆,避免光照,貯存于4℃。
· mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合,以1 N NaOH調(diào)整pH至5.5(pH很重要),貯存于4℃。
· 固定溶液(fixative)︰冰醋酸與甲醇以1︰3之體積比例混合,使用前才配制。
步驟:
· 培養(yǎng)Vero細(xì)胞: Vero細(xì)胞可作長(zhǎng)期培養(yǎng)或制作多個(gè)冷凍保存管,測(cè)試前解凍培養(yǎng)。測(cè)試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。
· 在接種測(cè)試樣品前一日,以trypsin-EDTA溶液處理Vero細(xì)胞,制成細(xì)胞懸浮液,以1~2x10^4 cells/ml培養(yǎng)于chamber slide中,每個(gè)well加入1ml細(xì)胞懸浮液,于37℃, 5%CO2培養(yǎng)。隔日確定生長(zhǎng)良好后,即可接種測(cè)試樣品。
· 接種測(cè)試樣品:樣品種類(lèi):1ml待測(cè)之培養(yǎng)基,1ml待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液(可將細(xì)胞稍微刮下),0.05~0.1ml冷凍管之細(xì)胞懸浮液。
· 將測(cè)試樣品加入chamber slide內(nèi),培養(yǎng)5天后,進(jìn)行Hoechst 33258的熒光染色觀察。
· 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細(xì)胞作為正反應(yīng)對(duì)照組﹙或是已感染支原體之細(xì)胞培養(yǎng)液或冷凍細(xì)胞液),負(fù)反應(yīng)對(duì)照組為Vero cell之新鮮培養(yǎng)基( αMEM 10鸖)。
DNA熒光染色檢測(cè)︰
· 取出培養(yǎng)5日之Vero細(xì)胞,吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,靜置10 min后,吸除固定液。重復(fù)上述之步驟,風(fēng)干10分鐘。
· 于每個(gè)well中,加入1 ml Hoechst 33258 working solution,室溫下靜置30 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后,以無(wú)菌水洗滌3次,風(fēng)干后加入1滴的mounting solution,并以蓋玻片覆蓋之。
· 以100x-400x熒光顯微鏡觀察。打開(kāi)水銀光源10 min后,以UV激發(fā)光束(330~380 nm)之濾光鏡,觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之熒光物產(chǎn)生。
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染,在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色熒光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致,與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其熒光可維持?jǐn)?shù)星期。

 

 

 
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