1. Fen細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,在25cm2培養(yǎng)瓶中生長到接近匯合。用含0.05%胰蛋白酶,0.02% EDTA的PBS消化細(xì)胞5分鐘,洗滌后,用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成1×105/ml。
2. 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加0.1ml細(xì)胞懸液,在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時,讓細(xì)胞帖壁。每孔加0.1ml效應(yīng)細(xì)胞懸液,效靶比10:1到50:1,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,讓效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮殺傷效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中,設(shè)立只有靶細(xì)胞的無殺傷對照和只有 效應(yīng)細(xì)胞的陰性對照,每種處理設(shè)3各復(fù)孔。
3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌各孔 3次,洗去不粘附的細(xì)胞。每孔加 0.1ml含2%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和10μl 5mg/ml的MTT染液,繼續(xù)培養(yǎng)3小時。
4. 用PBS洗滌2次,每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的異丙醇,室溫30分鐘,溶解形成的結(jié)晶。在570nm波長處,用酶聯(lián)檢測儀檢測各孔的光吸收值(OD)。
殺傷活性(%)=(OD實(shí)驗(yàn)孔-OD陰性對照) /OD無殺傷對照× 100