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流式細胞儀標(biāo)本的制備

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計算機等高技術(shù)發(fā)展起來的一種先進儀器,已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標(biāo)志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷,對淋巴細胞群和亞群進行精確分類,還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM檢測的標(biāo)本準(zhǔn)備,染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察,在某些實驗條件下,活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的
結(jié)果。
  (一) 原理
  活細胞表面保留有較完整的抗原或受體,先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合,根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。
  (二) 操作步驟
     制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、
     胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)
                 ↓
         用10%FCS RPMI1640調(diào)整細胞濃度為
         5×106~1×107/ml
                 ↓
        取40μl細胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(5~50μl)
        的小玻璃管或塑料離心管,再加50μl 1∶20(用DPBS
        稀釋)滅活正常兔血清
                 ↓4℃ 30min
        用洗滌液洗滌2次,每次加洗滌液2ml左右
              1000rpm×5min
                 ↓
         棄上清,加入50μl工作濃度的羊抗鼠
         (或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物,充分振搖
                 ↓ 4℃ 30min
         用洗滌液洗滌2次,每次加液2ml左右
              1000rpm×5min
                 ↓
         加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本,一般加入
         1ml固定液,如制片后在熒光顯微鏡下觀察,
         視細胞濃度加入100~500μl固定液)
                 ↓
         FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察
          (標(biāo)本在試管中可保存5~7天)

  (三) 試劑和器材
  1. 各種特異性單克隆抗體。
  2. 熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體,滅活正常兔血清。
  3. 10% FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。
  4. 玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。
  (四) 注意事項
  1. 整個操作在4℃下進行,洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN3,上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。
  2. 洗滌要充分,以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合,出現(xiàn)假陰性。
  3. 加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體,降低和防止非特異性染色。
  4. 細胞活性要好,否則易發(fā)生非特異性熒光染色。
  附:
  1. DPBS (×10, 貯存液)
    NaCl 80g
    KCl 2g      蒸餾水加至1000ml
    Na2HPO4 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋
    KH2PO4 2g
  2. 洗滌液
    DPBS      900ml
    FCS 50ml (終濃度 5%)
    4%NaN3???50ml (終濃度0.2%)
  3. 固定液
    DPBS    1000ml
    葡萄糖    20g (終濃度2%)
    甲 醛    10ml
    NaN3   0.2g (終濃度0.02%)

 

 

 
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