大分子導(dǎo)入細胞技術(shù)

外源核酸、多肽導(dǎo)入受體細胞的方法繁多，大致可分為三類：化學(xué)方法、物理化學(xué)方法和生物學(xué)方法。化學(xué)方法常見的有磷酸鈣沉淀法、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和PEI介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法等；物理方法有電穿孔法，基因槍粒子轟擊法等；生物學(xué)方法中，目前主要是利用病毒作為外源核酸、多肽導(dǎo)入的工具，通過病毒感染將外源核酸、多肽導(dǎo)入受體細胞內(nèi)。

實驗　 細胞顯微注射技術(shù)

[實驗?zāi)康腯
1 了解細胞顯微注射的基本原理
2 掌握細胞顯微注射基本技術(shù)

[實驗原理]
顯微注射技術(shù)是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受體細胞的基因組內(nèi)，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體動物的子宮內(nèi)發(fā)育，從而獲得轉(zhuǎn)基因動物。它是目前基因轉(zhuǎn)移效率較好的一種基因轉(zhuǎn)移方法，可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進行轉(zhuǎn)移；外源基因的長度不受限制, 可達100kb ；實驗周期相對比較短。它的不足之處是：需要昂貴精密的設(shè)備；顯微注射操作復(fù)雜，需專門技術(shù)人員；導(dǎo)入外源基因整合位點和拷貝數(shù)無法控制；常導(dǎo)致插入位點附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變，可造成動物嚴重的生理缺陷。盡管如此，由于顯微注射技術(shù)直接對基因進行操作，整合率較高，因而仍是目前建立轉(zhuǎn)基因動物極為重要的方法。
顯微注射技術(shù)在植物、動物的細胞發(fā)育研究的應(yīng)用，為研究體內(nèi)生理和體外的生化過程架起橋梁，將特定的分子探針及衍生的細胞間質(zhì)成分導(dǎo)入活體細胞，為研究控制細胞功能的調(diào)控機制提供了新的視野。

[儀器、材料和試劑]
（一） 儀器和用具：
倒置顯微鏡（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）；
Leitz重型基座（用于安放顯微鏡和微操作儀）；
微操作儀：Leitz（手動系統(tǒng)，安在平臺上）或Eppendorf 5171（自動軸向微注射系統(tǒng)，可固定在顯微鏡的載物臺上）；
微注射器：Eppendorf 5242，也可選用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉針儀：水平拉針儀P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉針儀720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射針頭：可購買廠商拉制好的商品，也可用拉針儀自行拉制（可參照[方法與步驟]中的1.1注射針頭的拉制）。
細胞培養(yǎng)設(shè)備：細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、塑料平皿和蓋玻片等。
（二） 材料：
（三） 試劑：
緩沖培養(yǎng)基（含25mmol/L HEPES pH7.2）；注射緩沖液（10mmol/L H2PO4-和HPO42-，pH7.2，84mmol/L K ，17mmol/L Na ，1mmol/L EDTA）

[方法與步驟]
1． 材料準備
1.1 注射針頭的拉制
水平拉針儀：裝上一根毛細管，擰緊左右兩側(cè)的夾子，做好固定，并使其中間部位對準加熱絲。設(shè)定好電流、拉力和時間。然后按開始鍵，等待毛細管被拉成兩個所需的微注射針頭。
垂直拉針儀：把玻璃毛細管固定在上面的夾子上，使其對準加熱絲后旋緊。抬起下面的滑夾，固定在毛細管上。調(diào)整熱度和螺線管范圍。
使用拉針儀自行拉制的微注射針頭，最好使用硼硅酸鹽玻璃的毛細管�？梢圆捎霉柰閷ψ⑸溽橆^進行處理，以防樣品和培養(yǎng)基成分與玻璃的親水表面相互作用，從而引起針尖阻塞而影響注射。
1.2 蓋玻片的處理
1 把蓋玻片放在陶瓷或金屬架上，相互不要接觸。
2 在裝有自來水的燒杯中，快速浸泡和沖洗。
3 在紙巾上把架子控干，再放入盛有0.1mol/L HCl的燒杯中，溫育過夜。
4 用自來水沖洗蓋玻片，每次10min，共5次。
5 把架子浸入70%的乙醇中，溫育60min。
6 用去離子水短暫沖洗，放在紙巾上控干。
7 在室溫下自然干燥30min。
8 在220～250℃烤6 h。
1.3 顯微注射用細胞的準備
1 在注射前一天，把細胞鋪到直徑為10～15mm的蓋玻片上，每個蓋玻片250～1000個細胞。
2 在注射前，把帶有需要注射細胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移至新的組織培養(yǎng)皿中，迅速用金剛石筆在蓋玻片上劃一個十字或一個圓圈標記（金剛石筆使用前用70%乙醇沖洗，并在超凈臺中用火焰燒一下），然后加入3ml有緩沖液的培養(yǎng)基。

2．顯微注射操作過程
2.1　針頭裝液
1　使用無菌的微量加樣器從微注射針頭的后部加入0.5～1μl的注射樣品。
2　使用玻璃毛細管拉出毛細管針頭，里面有與毛細管平行的細絲，有利于液體從后部向針頭方向運動。只需在針頭后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他東西接觸，就足以使少量的樣品到達針尖部。
2.2　針頭定位
1　將裝液后的針頭的游離端安在連接器上，然后旋緊連接器以固定針頭，再將其固定到微操作儀的托針管上。
2　把載有待注射細胞的蓋玻片轉(zhuǎn)移到里面有緩沖培養(yǎng)基的平皿中，將其放在中央。
3　將培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺上，盡量將蓋玻片上所畫圓圈的一個對準光照的中心區(qū)，這時光的亮度最好。
4　用低倍物鏡對準細胞調(diào)焦。
5　將針頭推入視野中心，在視野中針頭呈陰影狀。
6　輕輕的落下針頭，直至到達培養(yǎng)基中后停下。
7　通過顯微鏡觀察，移動針頭，必要時調(diào)整微操作儀，直到針頭的陰影在視野的上方。然后確定針頭的位置，使其約處在視野中心。
8　輕輕下調(diào)針頭，直到針頭變得清晰一些
2． 調(diào)到工作放大倍數(shù)，調(diào)準細胞焦距，找到針尖。
3． 如果找不到，重新使用低倍鏡，盡量將針頭調(diào)到視野的中心，重復(fù)上述的步驟。
10　小心下調(diào)針尖，直到其完全聚焦。
1.3 顯微注射的操作
2.3.1　手動細胞核內(nèi)注射
1 使用最低放大倍數(shù)（50×），把焦距對準位于蓋玻片上注射標記區(qū)域的細胞平面上。用肉眼將注射針頭對準到照度最亮處的中心，降下針頭，直到進入培養(yǎng)基。把針頭調(diào)入到視野的中心，輕輕放下針頭，直到看清楚為止。然后將放大倍數(shù)調(diào)至工作倍數(shù)，即320×，對準細胞表面調(diào)焦。將針頭調(diào)整到中心，下降針頭，對準焦距。移動顯微鏡載物臺，使針尖對準細胞核或核周的胞質(zhì)。
2 小心落下針尖，使其進入細胞核或核周的胞質(zhì)。
3 使用注射器施加注射壓
4 輕輕上提針頭，直到離開細胞。
5 移動顯微鏡載物臺，找到下一個細胞，重復(fù)2～4步驟。
2.3.2 自動細胞核內(nèi)注射和細胞質(zhì)內(nèi)注射
1 按上述手動系統(tǒng)的方法將針頭調(diào)整至視野中間，不同的是通過控制面板自動控制微操作部分。
2 工作放大倍數(shù)為320×，下降針頭，使之觸及細胞核或核周間隙上方的細胞表面，直到細胞表面見到一個輕微的壓跡。
3 通過控制部分，設(shè)定細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)內(nèi)注射的定位參數(shù)。
4 將針頭略提起，離開細胞表面幾微米，選擇一個新細胞，按下操縱桿上方的按鈕進行微注射。針頭首先在水平面上做逆向軌跡運動，然后朝向細胞做出一個迅速的軸向運動，正好刺入細胞內(nèi)預(yù)先設(shè)定好的坐標位置，這時微操作儀的控制部分，激活注射壓力，持續(xù)時間已經(jīng)預(yù)先設(shè)定好。針頭回到原來的位置。
5 在必要的情況下，可以在控制面板上修正各種參數(shù)，因為蓋玻片和平皿的表面不是十分平整，所以當(dāng)從蓋玻片的一個地方移動到另一個地方進行注射時，一定要重新調(diào)整細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)的坐標。

3　對注射了熒光標記物的細胞的分析
熒光標記物，如FITC-葡聚糖等常用來作注射用標記物，以分辨出已經(jīng)注射的細胞。濃度為0.25%～1%時，這種物質(zhì)的毒性很小，而且在細胞增殖的2～4天仍可見。
3.1 在PBS中輕輕沖洗注射過的細胞兩次。
3.2 用甲醇（2min）或PFA/GA（5min）快速固定
3.3 用去離子水快速沖洗蓋玻片。
3.4 滴一滴Mowiol，將蓋玻片裝到載玻片上。

[注意事項]
1 在整個過程中，注射針尖應(yīng)遠離人員和實驗室中的儀器。注射針在持針器上安裝不牢時，注射器、管子及注射針內(nèi)的壓力，可能將注射針射出。
2 在反向充填液體時，適當(dāng)?shù)卦陲@微鏡下觀察注射針尖，以決定在加壓時是否注射針阻塞或偏斜。阻塞通常可通過將針尖輕輕敲擊一個固定物而得以緩解。針尖偏斜的注射針是適合于顯微注射的，但其使用應(yīng)做細微調(diào)整或補償注射中加壓所造成的額外偏斜。
3 注射速度過快能擾亂細胞質(zhì)成分，細胞裂解或細胞從底層移位。當(dāng)注射體積小于估計的細胞體積的50%，并且注射樣品的流動速度幾乎不導(dǎo)致可見的細胞質(zhì)移位時，注射效果最好。
4 用紫外光可看到注入標記物后的活細胞，但會對細胞造成不可恢復(fù)的損傷，因此應(yīng)盡可能縮短紫外光照射時間。
5 如果對已經(jīng)注射的細胞進行免疫熒光測定或其他處理，最好使用可固定的葡聚糖，以防在沖洗中造成標記物的擴散損失。

磷酸鈣細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

[實驗?zāi)康腯
1 了解細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理和基本方法
2 磷酸鈣沉淀法的基本技術(shù)要點

[實驗原理]
磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的一種將DNA導(dǎo)入真核細胞的轉(zhuǎn)染方法，磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結(jié)合。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞，被轉(zhuǎn)染的DNA可以整合到靶細胞的染色體中從而產(chǎn)生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細胞，不但適用于短暫表達，也可生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

[儀器、材料和試劑]
1　呈指數(shù)生長的真核細胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纖維細胞）
2　完全培養(yǎng)液（依所用的細胞系而定）
3　CsCl純化的質(zhì)粒DNA （10～50μg/次轉(zhuǎn)染，二次純化）
4　2×HEPES緩沖鹽水(HeBS)
(pH6.95～7.05)　50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調(diào)pH至6.95～7.05,過濾除菌后,-20℃保存?zhèn)溆谩?br />5　2.5mol/L CaCl2過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?br />6　磷酸緩沖鹽水（PBS）
7　37℃，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱
8　100mm組織培養(yǎng)平板
9　15ml錐形管

[方法與步驟]
1　傳代細胞準備　細胞在轉(zhuǎn)染前24ｈ傳代,待細胞密度達50%～60%滿底時即可進行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。
2　DNA沉淀液的準備　首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。
3 用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個過程需緩慢進行，至少需持續(xù)1～2min。
4 室溫靜置30min,出現(xiàn)細小顆粒沉淀。
5 將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。
6 在標準生長條件下培養(yǎng)細胞4～16h。除去培養(yǎng)液，用5ml　1×HeBS洗細胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。
7 收集細胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。

[注意事項]
1 在整個轉(zhuǎn)染過程中都應(yīng)無菌操作。
2 為獲得最佳實驗結(jié)果，DNA應(yīng)不含蛋白質(zhì)和酚。乙醇沉淀后的DNA應(yīng)保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解。
3 沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的DNA不能有效地粘附和進入細胞。
4 在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都可能導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。

電穿孔和電融合技術(shù)

【實驗?zāi)康摹?br />1．了解細胞電穿孔和電融合的基本原理
2．學(xué)習(xí)電穿孔和電融合基本技術(shù)

【實驗原理】
當(dāng)細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔。運用這一技術(shù)，許多物質(zhì)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)、藥物、抗體和熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法，電穿孔已被廣泛用于各種細胞類型，包括細菌、酵母、植物和動物細胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質(zhì)引入活細胞。與其他常用的導(dǎo)入外源物質(zhì)的方法相比，電穿孔具有很多優(yōu)點。首先，不必象顯微注射那樣使用玻璃針，不需要技術(shù)培訓(xùn)和昂貴的設(shè)備，可以一次對成百萬的細胞進行注射。第二，與用化學(xué)物質(zhì)相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學(xué)副作用。第三，因為電穿孔是一種物理方法，較少依賴細胞類型，因而應(yīng)用廣泛。實際上，對大多數(shù)細胞類型，用電穿孔法基因的轉(zhuǎn)移效率比化學(xué)方法高得多。
除了能使細胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場脈沖也能引起細胞融合，這一現(xiàn)象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物，胚胎細胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到100倍，最近，貼壁細胞的電融合還被用來研究細胞融合時細胞的骨架成分和細胞器的動力學(xué)重排。

【儀器、材料和試劑】
儀器：脈沖發(fā)生器；樣品池（一個盛細胞的容器和兩個平行的金屬電極）；CO2培養(yǎng)箱，顯微鏡；離心機，微量移液器，鑷子，剪刀，手術(shù)刀片，三角瓶，吸管，毛細管，離心管，載玻片，蓋玻片，NALGEN一次性濾器。
材料：外源DNA，對數(shù)生長中期細胞
試劑：
穿孔介質(zhì)（PM）：磷酸鉀 15mmol/L
MgCl2 　1mmol/L
蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　
HEPES 10mmol/L　調(diào)節(jié)pH至7.3
融合介質(zhì)（FM）：MgCl2 1mmol/L
甘露醇 280mmol/L
HEPES 　2mmol/L　調(diào)節(jié)pH至7.3

【方法與步驟】
懸浮細胞的電穿孔法：
1．電穿孔進行基因轉(zhuǎn)移
電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細胞中，操作步驟相似。本實驗中，我們以基因轉(zhuǎn)移為例。載入其他的分子時，只需把外源DNA換成所需分子即可。
1.1　使細胞在適宜的培養(yǎng)基中生長，用胰酶處理，收獲對數(shù)生長中期的細胞，并用腺酶處理。
1.2　在穿孔介質(zhì)（PM）中至少洗一次。洗細胞時，在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質(zhì)中重新懸浮細胞。
1.3　計數(shù)細胞，在PM中，濃縮細胞為大約1千萬細胞/ml。
1.4　將DNA加到細胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。
1.5　在電穿孔裝置上設(shè)置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數(shù)衰減函數(shù)的時間常數(shù)，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設(shè)備是CD脈沖型發(fā)生器，設(shè)定電容和并聯(lián)電阻，以達到合適的τ值。
1.6　將小池放進盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。
1.7　電處理后，向小池加1ml普通培養(yǎng)基，將細胞混合液從小池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器（培養(yǎng)皿或培養(yǎng)孔）中，再加入一些培養(yǎng)基使最終的培養(yǎng)基體積適量。然后，將樣品細胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。
1.8　在測定轉(zhuǎn)移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養(yǎng)的時間不同。
2．檢測電穿孔效率和細胞存活率
2.1 除用羅丹明偶聯(lián)葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯(lián)葡聚糖引入目標細胞的方法如前所述。
2.2 電穿孔后，用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。
2.3 電穿孔后30min，向細胞懸液中加30μl臺盼藍，孵育2min，然后用培養(yǎng)基洗滌。
2.4 在1000rpm下離心3min，收集細胞，將細胞重懸于PM中，終體積100μl。
2.5 將一滴細胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細胞，測定攝取熒光標記葡聚糖的百分數(shù)。
2.6 在亮視野鏡片下，死細胞可因染成藍色檢測出（攝取了臺盼藍），測定細胞存活的百分數(shù)。
2.7 在各種電場設(shè)定值下重復(fù)實驗，畫出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數(shù)的曲線。這一曲線就將顯示對特定細胞類型電穿孔的最優(yōu)條件。

懸浮生長細胞的電融合
融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進行高強度的電場脈沖前后，必須用低幅、高頻電場使細胞排成一條鏈。
1．用融合介質(zhì)（FM）洗懸浮細胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細胞時，在臺式離心機上1000rpm下離心3分鐘，得到細胞沉淀，棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質(zhì)中。
2．將懸浮細胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的融合室內(nèi)。假如要使兩種不同的細胞彼此融合，轉(zhuǎn)移前要充分混合。
3．啟動介電電泳場，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內(nèi)，用顯微鏡檢測細胞是否排成一條鏈，調(diào)節(jié)振幅和頻率以達到最佳效果。
4．讓介電電泳場開約1分鐘后關(guān)掉，立即應(yīng)用融合脈沖，其振幅數(shù)量級為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場，常規(guī)讓其開啟約2分鐘。
5．關(guān)掉介電電泳場，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。
6．去掉FM，用普通培養(yǎng)基再次洗滌細胞。
7．將細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿，加入普通培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

【注 意 事 項】
1．最優(yōu)組分依使用的特定細胞種類而有明顯的變化。如果努力優(yōu)化電壓和脈沖寬度電穿孔結(jié)果仍不令人滿意，就應(yīng)嘗試改變穿孔介質(zhì)。
2．影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態(tài)有關(guān)，為達到最高效率，必須收集對數(shù)生長中期的細胞。